福建地區(qū)漢族人群骨保護素基因rs2073617T/C多態(tài)性與急性冠脈綜合征病變程度的關系

羅助榮，林 毅，張克己，鄭磊磊，徐高陽

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

自發(fā)現(xiàn)骨保護素(osteoprotegerin，OPG)在骨代謝調(diào)節(jié)中的重要功能以來，因其在血管性疾病和動脈粥樣硬化中發(fā)揮的重要作用引起了人們的廣泛關注［1］。但有關OPG基因多態(tài)性與急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的關系，國內(nèi)鮮見文獻報道。本研究旨在分析OPG基因啟動子rs2073617T/C位點基因在福建漢族人群中的分布情況，以初步了解其多態(tài)性與ACS的發(fā)病及病變程度是否存在相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 ACS組360例均符合ACS診斷標準［2-3］，其中男 216例，女144 例；對照組 120 例，男62例，女58例，均為福建地區(qū)無血緣關系漢族人。排除標準：合并有急慢性感染、惡性腫瘤、風濕性心臟病、瓣膜鈣化、嚴重肝腎功能異常、重度心功能衰竭、甲狀腺或腎上腺功能紊亂、鈣代謝異常及免疫系統(tǒng)疾病等均予排除。

1.2 方法

1.2.1 冠狀動脈造影 采用Judkins法按常規(guī)操作。根據(jù)1984年美國心臟協(xié)會規(guī)定的冠脈血管圖像分段評價標準：冠脈造影顯示任何1、2、3枝主要冠狀動脈一段狹窄＞50%為單枝、雙枝、三枝病變，左主干病變計為2枝病變。根據(jù)Gensini積分系統(tǒng)對各枝血管狹窄程度進行定量分析：無異常發(fā)現(xiàn)為0分、狹窄＜25%為1分、26% ～50%為2分、51%～75%為4分、76% ～90%為8分、91% ～99%為16分、100%為32分，患者冠狀動脈病變程度的最終積分為各分枝積分之和。

1.2.2 生化指標測定 清晨空腹采肘靜脈血5 ml，3000 r/min(離心半徑8 cm)，離心10 min取血清，采用Olympus Au2700全自動生化分析儀檢測。

1.2.3 靜脈血基因組DNA提取 所有受試者禁食12 h后清晨空腹采血，EDTA抗凝，采用美國OMEGA公司全血DNA分離提純試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存。

1.2.4 PCR擴增 應用多聚合酶鏈式反應(PCR)擴增OPG基因啟動子rs2073617T/C多態(tài)性片段。PCR引物采用Primer Premier 5.0軟件設計，由上海生工公司合成。OPG rs2073617T/C上游引物序列：5’-GAAGTGAAGGGGTCAGGCAGC-3，下游引物序列：5’-GTCTGTCTCTCTCTTGCTGTCTTCC-3，擴增反應體系 20μl，其中含滅菌雙氧水 12.8μl，10 × PCR反應緩沖液 2μl，dNTPs 0.4μl，上游引物(10μM)0.4μl，下游引物(10 μM)0.4μl，DNA 模板 2μl，Taq酶2 U，覆蓋石蠟油。反應條件為：95℃預變性3 min；95℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán) 35 次；72℃ 5 min；2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照。

1.2.5 擴增產(chǎn)物的限制性酶切和DNA測序檢測 OPG rs2073617T/C PCR產(chǎn)物分別用HincII限制性酶(TaKaRa公司)于37℃水浴消化16 h，并經(jīng)電泳證實。同時PCR產(chǎn)物利用ABI370型DNA測序儀(ABI公司，USA)進行測序鑒定。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件。計算各基因型及等位基因頻率，兩組間基因型分布做Hardy-Wrinberg平衡分析，以確定研究樣本的群體代表性。計量資料以表示。組間計量資料比較采用方差分析或t檢驗，各組之間基因型和等位基因頻率分布采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組年齡、性別、體重指數(shù)、高血壓、三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，ACS組吸煙、糖尿病、HDL-C顯著高于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 研究對象的Hardy-Weinberg平衡檢驗 OPG基因rs2073617T/C多態(tài)性基因型分布在兩組中的觀察值與理論值相吻合，表明研究對象符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。

2.3 OPG rs2073617T/C基因多態(tài)性 經(jīng)HincII限制性酶酶切后可見三種基因型：855 bp處出現(xiàn)單個條帶為TT純合子，雜合子TC產(chǎn)生855 bp、460 bp和395 bp三條帶；純合子CC產(chǎn)生395 bp，460 bp二條帶。DNA測序鑒定的結果亦證實上述rs2073617T/C位點3種基因型的存在。電泳圖和測序圖見圖1、圖2。

圖1 OPG基因rs2073617T/C酶切電泳及測序結果

圖2 OPG基因rs2073617T/C測序結果

2.4 OPG基因rs2073617T/C多態(tài)性分布與比較與對照組比較，ACS組OPG基因rs2073617T/C多態(tài)位點的基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)，見表2。

表2 基因型及等位基因頻率在兩組間的分布［例(%)］

2.5 OPG rs2073617T/C位點多態(tài)性與ACS病變程度的關系 ACS患者根據(jù)冠脈造影結果分為單枝、雙枝、三枝病變組。其中單枝病變組166例、雙枝病變組100例和三枝病變組94例，對照組120例。OPG rs2073617T/C各基因型在四組之間比較的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3。ACS患者三種基因型與冠狀動脈Gensini評分間的差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表4。

表3 OPG rs2073617T/C位點多態(tài)性與ACS病變枝數(shù)的關系［例(%)］

表4 OPG rs2073617T/C基因多態(tài)性與冠脈病變枝數(shù)Gensini評分的關系

3 討論

OPG于1997年在美國和日本兩家實驗室同時被發(fā)現(xiàn)［4-5］，它是一種分泌型糖蛋白，其前體含有401個氨基酸的殘基，N-末端的21個氨基酸為信號肽序列，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，其mRNA在多種組織廣泛表達，如心臟、肺、甲狀腺、腎臟和骨等。它與細胞核因子kB受體活化因子配體(RANKL)，核因子kB受體活化因子(RANK)組成OPG/RANKI/RANK系統(tǒng)。OPG系統(tǒng)與骨代謝，心血管系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)疾病等都有著密切的關聯(lián)。

Palazzuoli等［6］發(fā)現(xiàn)OPG水平在穩(wěn)定性冠心病中明顯增高，但低于ST段抬高的心肌梗死患者。不穩(wěn)定心絞痛和非ST段抬高的心肌梗死OPG水平升高但無顯著差異。Omland等［7］研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的危險因素相比，OPG可以更好的預測急性冠脈綜合征患者遠期死亡率和心力衰竭的發(fā)生。以上研究表明，OPG不僅能夠參與骨代謝，而且參與動脈粥樣硬化的進展，并與ACS的發(fā)病及預后密切相關。因此，探討OPG基因多態(tài)性與ACS間的相關性具有重要意義。

人類OPG基因是單拷貝基因序列，全長29 kb，位于染色體8q23-24上具有5個外顯子。國外一些學者［8］初步發(fā)現(xiàn) OPG 950以及1181位點，其多態(tài)性與血管中層鈣化密切相關。我們研究發(fā)現(xiàn)在福建地區(qū)漢族人群中，OPG基因rs2073617T/C多態(tài)性存在TC、TT、CC三種基因型，其在ACS組和對照組中的頻率分別為 43.3%、33.3%和 23.3%，以及47.7%、26.7%和25.6%，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)；Ohmori等［9］對日本男性冠心病患者血清OPG進行研究，結果顯示OPG基因型950C/C與ACS顯著相關，并且與血清OPG水平的升高有關。本研究根據(jù)造影結果將ACS患者分為單枝、雙枝、多枝病變組，并分析其與OPG基因多態(tài)性的關系，結果發(fā)現(xiàn)OPG基因rs2073617T/C基因型及等位基因頻率與冠狀動脈病變枝數(shù)間差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)；對ACS患者病變程度Gensini評分，分析其與三種基因型間的關系顯示差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。Soufi等［10］研究發(fā)現(xiàn) OPG不同位點的基因型與冠心病相關性差異較大，應用多聚合酶鏈式反應-梯度凝膠電泳判別OPG基因發(fā)現(xiàn)存在多個突變位點：149 T/C、163 A/G、209 G/A、245 T/G、950 T/C(以上位點都在啟動子區(qū)域)、1181 G/C(位于第l外顯子)6890 A/C(位于第4內(nèi)含子)。單個位點基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生雖無獨立相關性，但950 T/C和1181 G/C位點的聯(lián)合多態(tài)性分析顯示攜帶950 TC/1181 GC或950 CC/1181 CC基因型的患者具有冠心病發(fā)病的高危因素。

本研究發(fā)現(xiàn)OPG基因rs2073617T/C多態(tài)性與福建地區(qū)漢族人群中ACS的發(fā)生及冠狀動脈病變程度無相關性。但并不能說明OPG基因多態(tài)性與ACS沒有關系，因為本研究僅選取了OPG基因的一個多態(tài)性位點，即OPG 950位點，很明顯探討OPG基因多個位點及連鎖多態(tài)性與ACS的相關性將更具有意義。

［1］羅助榮.骨保護素系統(tǒng)與動脈粥樣硬化的研究進展［J］.東南國防醫(yī)藥，2010，12(6)：523-525.

［2］中華醫(yī)學會心血管病學分會.不穩(wěn)定型心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南［J］.中華心血管病雜志，2007，35(4)：295-304.

［3］Antman EM，Armstrong PW，Bates ER，et al.2007 Focused Update of the ACC/AHA 2004 Guidelines for the Management of Patients With ST-Elevation Myocardial Infarction［J］.JACC，2008，51(2)：210-247.

［4］Sirnonet WS，Laeey DL，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerin：a novel seelated protein involved in the regulation of bone density［J］.Cell，1997，89(2)：309-319.

［5］Tsuda E，Goto M，lVlochizuki S，et al.Isolation of a novel cytokinefrom hurmn fibroblasts that specifically inhibits osteoclastogenesis［J］.Bioehem Biophys Res Contain，1997，234(1)：137-142.

［6］Palazzuoli A，Ascione R，GallottaM，et al.Osteoprotegerin and B-type natriuretic peptide in acute coronary syndromes with preserved systolic function：relationto coronary artery disease extension［J］.Int J Cardiol，2009，137(3)：295-298.

［7］Omland T，Ueland T，Jansson AM，et al.Circulating osteoprotegerin levels and long-term prognosis in patients with acute coronary syndromes［J］.J Am Coll Cardiol，2008，51(3)：627-633.

［8］Hofbauer LC，Schoppet M.Osteoprotegerin gene polymorphism and the risk of osteoporosis and vascular disease［J］.JACC，2002，87(9)：4078-4079.

［9］Ohmori R，Momiyama Y，Taniguehi H，et al.Association between osteoprotegerin gene polymorphism and coronary artery disease in Japanese men［J］.Atherosclerosis，2006，187(1)：215-217.

［10］Soufi M，Schoppet M，Sattler AM，et al.Osteoprotegerin gene polymorphisms in men with coronary artery disease［J］.Clin Endocrinol Metab，2004，89(8)：3764-3768.