肥大細(xì)胞在肥胖相關(guān)性腎病腎組織損傷中的作用

王旭方 張明超 鄭春霞 陳 浩 侯金花 葛永純 謝紅浪 劉志紅

近年來，我國肥胖的發(fā)生率正逐年升高。作為心血管疾病、糖尿病、高血壓、脂質(zhì)代謝紊亂等疾病的重要危險因素，肥胖已成為威脅我國公共衛(wèi)生的重大問題［1］。肥胖除了作為慢性腎臟病和終末期腎功能衰竭的危險因素外，還可以引起蛋白尿、腎組織損傷及腎功能減退，即肥胖相關(guān)性腎病(obesity related glomerulopathy，ORG)［2］。

我們以往的工作顯示，我國ORG的發(fā)病率呈快速上升趨勢［3］。足細(xì)胞密度和數(shù)量的下降與ORG蛋白尿及腎功能損傷呈顯著相關(guān)性［4］，控制體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)有助于蛋白尿的緩解。但同時我們也發(fā)現(xiàn)，并非所有BMI和尿蛋白下降患者其腎功能都維持穩(wěn)定或得到一定程度恢復(fù)，部分腎活檢時存在較重的腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化病變者，其腎功能預(yù)后不佳;進(jìn)一步分析腎功能的影響因素，證實腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化對腎功能進(jìn)展有預(yù)測作用［5］。然而目前ORG腎小管損傷機(jī)制尚不清楚，零星報道認(rèn)為腎臟局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)激活、脂質(zhì)沉積和氧化應(yīng)激等可能對腎小管損傷有一定作用［6，7］。

隨著研究深入，越來越多的證據(jù)表明炎癥在ORG的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要功能。ORG腎小球基因譜的研究發(fā)現(xiàn)有關(guān)炎性因子的基因表達(dá)明顯上調(diào)，表明炎癥反應(yīng)在ORG的發(fā)生和發(fā)展中可能有重要作用［8］。肥胖患者脂肪組織巨噬細(xì)胞能夠分泌腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素 6(interleukin-6，IL-6)和 IL-1β等多種炎性因子［9］，通過誘發(fā)胰島素抵抗、促進(jìn)細(xì)胞游離脂肪酸攝取及促進(jìn)動脈粥樣硬化形成等間接影響腎臟結(jié)構(gòu)及功能［10］。體內(nèi)實驗證實，肥大細(xì)胞也參與了肥胖個體脂肪組織炎癥反應(yīng)［11］。肥大細(xì)胞敲除或使用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑，可使小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，炎性因子水平顯著下降，體重減輕。但肥大細(xì)胞在ORG中發(fā)揮何種功能目前尚無研究報道。

基于以上研究，我們對ORG患者肥大細(xì)胞的數(shù)量、分布特點(diǎn)及其與臨床病理特征的聯(lián)系進(jìn)行觀察，探討肥大細(xì)胞與ORG腎組織損傷及病情進(jìn)展之間的關(guān)系。

對象與方法

病例選擇 結(jié)合臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及腎活檢確診的ORG患者39例，其中男性23例，女性16例，均為中年患者。全部患者滿足以下條件:(1)BMI≥28 kg/m2［3］，排除內(nèi)分泌性、藥物性肥胖，排除糖尿病，可伴有空腹血糖升高(＜7.0 mmol/L)或糖耐量異常;(2)臨床表現(xiàn)為不同程度的蛋白尿(尿蛋白排泄量＞0.4 g/24h)，無肉眼血尿，鏡下血尿＜10萬/ml;(3)腎臟病理表現(xiàn)為腎小球肥大，伴或不伴有局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)，免疫熒光染色為寡免疫復(fù)合物沉積，可伴有IgM、C3非特異性或節(jié)段沉積;(4)結(jié)合臨床、病理改變，除外肥胖患者合并有其他腎臟疾病，如IgA腎病、膜性腎病、糖尿病腎病、高血壓腎損害等;(5)排除支氣管哮喘、藥物過敏及3個月內(nèi)有感染的患者;同時選取10例性別年齡匹配的健康移植供腎組織標(biāo)本作為正常對照，所選供者無高血壓、肥胖、糖脂代謝紊亂、支氣管哮喘及藥物過敏等病史，組織病理分析無明顯病變。

臨床資料采集 詳細(xì)采集病史，記錄研究對象腎活檢時性別、年齡、腎臟病病程、既往用藥史，特別是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)的使用情況。體格檢查記錄身高、體重、血壓。常規(guī)方法測定24小時尿蛋白定量、尿N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶(NAG)、尿視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，RBP)、13h 禁水禁食尿滲量，采用日立7180自動生化分析儀檢測空腹血糖、尿素氮、血清肌酐(SCr)、尿酸、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、C反應(yīng)蛋白(CRP)，記錄IgE水平。

高血壓定義為收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg;空腹血糖受損為6.1 mmol/L≤空腹血糖＜7.0 mmol/L，糖耐量異常為7.8 mmol/L≤餐后2h血糖＜11.1 mmol/L兩者均可稱為糖代謝異常;血脂紊亂為總膽固醇＞6.2 mmol/L，或三酰甘油＞2.2 mmol/L，或 LDL＞3.1 mmol/L，或 HDL＜1.0 mmol/L;腎功能減退為采用MDRD公式計算的腎小球濾過率(eGFR)＜90 ml/(min·1.73m2)及 SCr＞109.6 μmol/L;尿蛋白定量＞3.5 g/24h為大量蛋白尿。

腎活檢組織病理 腎臟穿刺活檢組織經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度為2 μm，常規(guī)行 HE、PAS、PASM-Masson和Masson三色染色。免疫病理采用冰凍切片直接免疫熒光法。

腎組織類胰蛋白酶(tryptase)及CD68免疫組織化學(xué)染色 tryptase存在于肥大細(xì)胞分泌顆粒中，是肥大細(xì)胞的特異性標(biāo)志［12］，因此本研究選取tryptase染色陽性細(xì)胞作為肥大細(xì)胞，同時以CD68染色陽性細(xì)胞為巨噬細(xì)胞進(jìn)行觀察。石蠟切片脫蠟，用3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，10 mmol/L檸檬酸鹽緩沖劑(pH 6.0)條件下高溫高壓修復(fù)抗原，再加入10%小牛血清封閉。加入鼠抗人tryptase 抗體(1∶1 000，MAB-1222，Chemicon)或鼠抗人 CD68 抗體(1∶150，PG-M1，Dako)，室溫孵育 2h，PBS沖洗3遍，然后加二抗EnVision(Dako)孵育30 min。以 DBA顯色，蘇木素復(fù)染核，中性樹膠(Sigma)封片，置顯微鏡(Olympus BX51)下觀察。以同等濃度的非免疫兔血清IgG(Dako)替代一抗作為陰性對照。

腎組織tryptase及CD68雙重免疫熒光染色石蠟切片如前步驟脫蠟、修復(fù)抗原后，加入Avidin/biotin各15 min，10%小牛血清封閉10 min，加鼠抗人 CD68(Dako，1∶150)室溫孵育 2h，加生物素化抗鼠IgG孵育30 min，PBS漂洗三次，再加德克薩斯紅Avidin DCS(Vector Laboratories，CA，1∶300)孵育 10 min，PBS沖洗 30 min。加鼠抗人 tryptase一抗(Chemicon，1∶1 000)孵育2h，加 FITC 標(biāo)記的兔抗鼠IgG孵育30 min。甘油封片，共聚焦熒光顯微鏡(LSM510，Carl Zeiss)下觀察并掃描采集圖像。

結(jié)果判斷 所需觀察的病理切片由2名腎臟病理醫(yī)師盲法評估，詳細(xì)記錄腎小球球性硬化、節(jié)段硬化、近端腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤、小動脈透明變性等情況。腎小球病變以病變小球占腎組織總小球數(shù)的百分比記錄，腎小管間質(zhì)病變根據(jù)皮質(zhì)區(qū)病變累及的面積對每種病變進(jìn)行半定量評分，受累面積＜1%為0分，1～25%為1分，25% ～50%為2分，＞50%為3分。細(xì)胞計數(shù):在400倍放大顯微鏡下，以目鏡測微器觀察16個連續(xù)不重疊的腎皮質(zhì)(包括腎小管間質(zhì)及腎小球周圍)視野，避開腎小球或大血管，所得數(shù)值之和為每mm2肥大細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的個數(shù)。每張切片觀察48個視野，取3次觀察的平均值為最終結(jié)果。

統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，以單樣本Kolmogorov-Smirnov Z檢驗對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料以百分率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗;變量間的相關(guān)性以pearson、spearman等相關(guān)系數(shù)評價;均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01時差異非常顯著。

結(jié) 果

臨床特征 39例患者平均BMI(32.3±3.5)kg/m2。腎臟損害以蛋白尿為主，平均蛋白尿水平0.93 g/24h，其中3例患者表現(xiàn)為大量蛋白尿。平均eGFR(103.4±29.3)ml/min，其中2例患者eGFR＜60 ml/(min·1.73m2)。11例患者腎活檢病理表現(xiàn)為FSGS樣病變，其余患者均表現(xiàn)為單純腎小球肥大。ORG患者與對照組年齡及性別組成無明顯差異，但29例合并高血壓，22例合并糖代謝異常，34例合并血脂紊亂，3例患者血清IgE水平升高。

肥大細(xì)胞數(shù)量及分布特點(diǎn) ORG患者腎組織肥大細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著高于對照組［(16.81±10.99)vs(6.33 ±2.51)，P＜0.01］(圖 1)，其主要分布于皮質(zhì)區(qū)的腎間質(zhì)，以萎縮的腎小管和間質(zhì)纖維化處更多見，并可見腎小管炎，多見于萎縮的腎小管(圖2)，髓質(zhì)區(qū)肥大細(xì)胞數(shù)量較少。腎小球內(nèi)未見肥大細(xì)胞，但球囊周圍可見肥大細(xì)胞浸潤，部分小血管周圍也可見肥大細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)可見較多脫顆粒的肥大細(xì)胞(圖3)。

圖1 肥大細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在肥胖相關(guān)性腎病(ORG)患者腎組織中的分布(IH，×200)

圖2 肥胖相關(guān)性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞分布特點(diǎn)及其與病理指標(biāo)的相關(guān)性

肥大細(xì)胞與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示肥大細(xì)胞數(shù)量與 BMI(r=0.364，P＜0.05)、血壓(收縮壓:r=0.459，P＜0.01，舒張壓:r=0.347，P＜0.05)、腎小管損傷指標(biāo) NAG(r=0.324，P＜0.05)以及腎功能指標(biāo)(SCr:r=0.637，P＜0.01，eGFR:r=-0.559，P＜0.01)呈相關(guān)性(表1)。Spearman相關(guān)分析提示肥大細(xì)胞數(shù)與腎小球球性硬化(r=0.409，P＜0.01)、節(jié)段硬化(r=0.457，P＜0.01)、腎小管萎縮(r=0.470，P＜0.01)和腎間質(zhì)纖維化(r=0.669，P＜0.01)呈顯著正相關(guān)(圖2)，而與間質(zhì)炎細(xì)胞數(shù)量及小動脈透明變性無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。腎活檢病理表現(xiàn)為FSGS的患者其肥大細(xì)胞數(shù)量高于單純腎小球肥大的患者［16(6～49)vs10(4～36)，P＜0.05］。本研究未發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞數(shù)量與性別、年齡、肥胖病程、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、尿蛋白、RBP、IgE及CRP水平等指標(biāo)的相關(guān)性(表1)。

表1 肥胖相關(guān)性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞與臨床指標(biāo)的關(guān)系

為探討腎功能的影響因素，對與eGFR存在相關(guān)性的臨床和病理指標(biāo)進(jìn)行多元回歸分析，提示肥大細(xì)胞數(shù)量是影響eGFR的獨(dú)立因素(R2=0.44，P＜0.05)。

圖3 肥胖相關(guān)性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞與腎小管炎(IH，×800)

巨噬細(xì)胞分布特點(diǎn)及其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 ORG腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤也顯著高于對照組，［11(1～34)vs6(1～10)，P＜0.05］(圖1)。巨噬細(xì)胞主要分布在有炎性細(xì)胞浸潤的腎間質(zhì)中，腎小球內(nèi)也有少量分布。腎組織tryptase與CD68雙重免疫熒光染色見肥大細(xì)胞與巨噬細(xì)胞在腎間質(zhì)中的分布部位一致(圖4)。

Spearman相關(guān)分析提示腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞數(shù)量與間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤程度(r=0.476，P＜0.01)呈正相關(guān)，而與BMI、收縮壓、空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、NAG、RBP、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化程度及肥大細(xì)胞數(shù)量等無明顯相關(guān)性。

討 論

ORG起病相對隱匿，臨床上以輕、中度蛋白尿為主要表現(xiàn)，病理上主要表現(xiàn)為腎小球體積增大，伴或不伴FSGS樣病變，同時伴有腎小管功能異常［13］。有研究報道ORG 5年腎存活率為77%，10年僅為51%［14］。既往研究認(rèn)為降低蛋白尿是延緩ORG腎功能進(jìn)展的主要措施之一，而體重控制可以顯著降低ORG患者的蛋白尿水平。但預(yù)后分析證實，腎小管間質(zhì)的損傷程度，而非體重及尿蛋白水平，是決定腎功能進(jìn)展的重要因素［5］。然而目前關(guān)于ORG腎小管間質(zhì)損傷機(jī)制仍不是很清楚。

圖4 肥胖相關(guān)性腎病患者腎組織肥大細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的關(guān)系

肥大細(xì)胞起源于多能造血祖細(xì)胞，進(jìn)入組織中完成其分化，在過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要功能。但近期也有研究證實肥大細(xì)胞參與了肥胖的發(fā)生發(fā)展過程［11］。肥胖患者脂肪組織肥大細(xì)胞數(shù)量較正常人明顯升高，而肥大細(xì)胞敲除小鼠其體重及體內(nèi)炎性因子水平及脂肪組織巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯下降，同時，肥大細(xì)胞也參與了白色脂肪組織蛋白酶的表達(dá)及微血管的形成。但肥大細(xì)胞在ORG中的作用目前尚無相關(guān)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)ORG患者腎組織肥大細(xì)胞浸潤數(shù)量高于正常人，并與BMI水平呈正相關(guān)。白色脂肪組織中的定向造血干細(xì)胞可以分化為有功能的肥大細(xì)胞并遷移到不同組織［15］。而肥胖過程中腎組織糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)和脂質(zhì)沉積、活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生以及過敏毒素 C3a 受體表達(dá)上調(diào)［2，16］，其中C3a能夠趨化肥大細(xì)胞，而AGEs、ROS及LDL均能使肥大細(xì)胞激活［17］。因此肥胖個體可能通過上述途徑引起了腎組織肥大細(xì)胞的浸潤及激活。肥大細(xì)胞與血壓水平也呈正相關(guān)性，高血壓腎損害患者的腎組織肥大細(xì)胞浸潤也顯著升高，伴隨干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)表達(dá)上調(diào)［18］。SCF 在正常腎組織表達(dá)微弱，但在疾病過程中表達(dá)上調(diào)。作為肥大細(xì)胞遷移和分化的主要刺激因子，SCF可能在肥大細(xì)胞向腎組織浸潤過程中也發(fā)揮著重要作用。

肥大細(xì)胞主要在ORG腎間質(zhì)纖維化處以及腎小球球囊周圍分布，可見較多脫顆粒的肥大細(xì)胞，其數(shù)量與腎小球球性硬化、節(jié)段硬化和間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)，提示肥大細(xì)胞可能參與了腎臟纖維化過程。肥大細(xì)胞能夠合成多種細(xì)胞因子、趨化因子和白三烯，可以招募并激活中性粒細(xì)胞［19］;脫顆粒釋放的組胺、TNF-α和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)能夠促進(jìn)纖維細(xì)胞合成膠原成分;肝素和tryptase可以引起成纖維細(xì)胞的遷移及增生［20］;類糜蛋白酶(chymase)還可以影響基質(zhì)金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織型抑制劑(MMPs/TIMPs)的平衡而調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積［21，22］。另外肥大細(xì)胞也影響腎臟局部RAS系統(tǒng)。肥大細(xì)胞能夠合成腎素［23］，脫顆粒過程中釋放的腎素可以轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)［24］。并且chymase可以在不依賴血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)的情況下將AngⅠ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)［25］，體內(nèi)實驗證實ACEI治療可以逆轉(zhuǎn)肥大細(xì)胞引起的腎間質(zhì)纖維化并且減少肥大細(xì)胞浸潤數(shù)量［26］。以上均表明，肥大細(xì)胞具有促進(jìn)腎臟纖維化的潛能。

本研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞可以引起腎小管炎，其數(shù)量與腎小管萎縮程度呈正相關(guān)。本研究入組時排除了合并藥物過敏及感染的患者，并且腎組織肥大細(xì)胞數(shù)量與血清IgE及CRP等炎性因子水平未見明顯相關(guān)性，表明ORG患者肥大細(xì)胞引起腎小管炎的機(jī)制與過敏及感染引起的間質(zhì)性腎炎有所不同。腎小管炎可以出現(xiàn)在多種非間質(zhì)性腎炎中，如在移植腎，其出現(xiàn)提示急性排斥，腎臟預(yù)后不佳，而在糖尿病腎病及IgA腎病中，腎小管炎與腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及間質(zhì)纖維化有直接聯(lián)系［27］。因此腎小管炎的出現(xiàn)與腎小管間質(zhì)損傷有著重要聯(lián)系，而肥大細(xì)胞參與了這一過程，進(jìn)一步證實了炎癥在ORG腎損傷中的作用。

巨噬細(xì)胞在腎間質(zhì)纖維化中作用的研究比較廣泛。經(jīng)典途徑激活的M1型巨噬細(xì)胞可以分泌TGF-β、MMP-9和TNF-α等引起間質(zhì)纖維化，也可以通過血管損傷和組織缺氧引起腎小管萎縮［28］。而肥胖小鼠脂肪組織中，巨噬細(xì)胞可以被肥大細(xì)胞招募并分泌炎癥因子引起胰島素抵抗［11］。本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞與肥大細(xì)胞在腎間質(zhì)中的分布有一定的一致性，其數(shù)量與間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)，但未能明確其與肥大細(xì)胞數(shù)量及間質(zhì)纖維化的關(guān)系。因此ORG腎間質(zhì)損傷中巨噬細(xì)胞與肥大細(xì)胞相互作用的關(guān)系及其在組織損傷中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，ORG患者腎間質(zhì)肥大細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯增多，其程度與BMI、血壓、腎間質(zhì)損傷及腎功能進(jìn)展之間存在顯著相關(guān)性。進(jìn)一步闡明肥大細(xì)胞在ORG患者腎間質(zhì)損傷及腎功能進(jìn)展中的作用，探索有針對性的干預(yù)措施，將有助提高ORG的診治水平。

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