低黏度包埋劑在腎活檢電鏡標(biāo)本制備中的應(yīng)用

朱小東 曾彩虹 陳惠萍

腎活檢病理診斷由光鏡、免疫熒光、電鏡三部分組成，電鏡技術(shù)對(duì)腎臟病的診斷及分類具有極其重要的作用。環(huán)氧樹脂Epon 812是目前腎活檢常規(guī)電鏡檢查中應(yīng)用最廣泛的包埋樹脂，但聚合硬化時(shí)間長以致電鏡標(biāo)本制作周期較長，影響臨床及時(shí)獲取電鏡觀察結(jié)果。有報(bào)道Eponate 12作為一種黏度低、滲透作用快、聚合時(shí)間短的電鏡包埋劑已應(yīng)用于快速電鏡技術(shù)，本文擬探討低黏度包埋劑Eponate 12在腎活檢電鏡中的應(yīng)用，旨在更好地提供腎活檢患者超微結(jié)構(gòu)改變特點(diǎn)以滿足臨床診斷的需要。

材料與方法

標(biāo)本來源 選取40例南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所常規(guī)腎活檢電鏡標(biāo)本，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各20例，每組包括IgA腎病(IgAN)5例、膜性腎病(MN)5例、狼瘡性腎炎(LN)5例、局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)5例。

試劑及配制 Eponate 12 Resin Kit With DMP-30(Product No.18010 TED PELLA.ICN，USA)，Epon 812、甲基內(nèi)次甲基二甲酸酐(NMA)、十二烷基琥珀酸酐(DDSA)、25%戊二醛、2%四氧化鋨、醋酸鈾及檸檬酸鉛(均購置SPI.USA)?；旌习駝┡渲品椒?以配制50 ml左右為例，單位ml)，Eponate 12包埋劑采用“HARD”配方，即 Eponate 12∶DDSA∶NMA∶DMP-30比例為 25.7∶9.3∶16.5∶0.8;Epon 812 包埋劑采用夏季配方，即Epon 812∶DDSA∶NMA∶DMP-30 比例為 25∶6.2∶18.9∶0.8。

實(shí)驗(yàn)方法

取材與固定 兩組標(biāo)本取材與固定處理程序相同。具體步驟:(1)取材、前固定，鋒利刀片切取1 mm3的組織塊，用專用鑷子輕夾放入4℃預(yù)冷的3.75%戊二醛電鏡固定液中，放置4℃冰箱固定4h;(2)漂洗，0.1M PBS緩沖液漂洗15 min×3次;(3)后固定、漂洗，1%鋨酸4℃固定1h;雙蒸水漂洗5 min×3次。

脫水、浸透與包埋、聚合

實(shí)驗(yàn)組 梯度乙醇脫水:50%乙醇10 min×1次，70%乙醇10 min×1次，90%乙醇10 min×1次，100%乙醇10 min×3次;浸透、包埋:環(huán)氧丙烷10 min×3次;Eponate 12混合包埋劑∶環(huán)氧丙烷比例為1∶1浸透1h，Eponate 12混合包埋劑浸透3h。

對(duì)照組 梯度丙酮脫水:30%丙酮15 min×1次，50%丙酮15 min×1次，70%丙酮15 min×1次，90%丙酮15 min×1次，100%丙酮10 min×3次;浸透、包埋:丙酮:Epon 812混合包埋劑比例為1∶1浸透1h，Epon 812混合包埋劑浸透3h。

聚合 腎組織標(biāo)本轉(zhuǎn)移至膠囊后放置烤箱內(nèi)，兩種處理方法見表1。

表1 采用不同包埋劑處理腎活檢電鏡組織的比較

切片及染色 Leica EM超薄切片機(jī)1 μm半薄切片，1%甲苯胺藍(lán)染色1 min，光鏡定位腎小球及腎小管。超薄切片銀白色厚約60～70 nm，選擇干凈且覆膜完好的銅網(wǎng)撈片，觀察撈片有無褶皺、裂痕，待切片干燥后進(jìn)行醋酸鈾、檸檬酸鉛常規(guī)雙染色，分別為20 mim和15 min，切片完全干燥后日立H7500型透射電子顯微鏡下觀察。

電鏡下觀察 電鏡觀察的內(nèi)容包括切片是否均勻完整，有無皺褶、震顫、變形;超薄切片的染色性能和圖像反差是否良好;組織、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)是否保存良好，超微結(jié)構(gòu)的完整性和清晰度，有無物質(zhì)抽提和聚集。

結(jié) 果

腎活檢電鏡標(biāo)本處理時(shí)間 實(shí)驗(yàn)組腎活檢電鏡標(biāo)本從脫水到完全聚合耗時(shí)約17.5h，與對(duì)照組Epon 812包埋方法相比時(shí)間縮短約48～60h，從而縮短整個(gè)腎活檢標(biāo)本制樣周期(表2)。

表2 Eponate 12與Epon 812標(biāo)本制樣耗時(shí)比較

超薄切片質(zhì)量 實(shí)驗(yàn)組Eponate 12包埋劑在60℃溫箱中12h達(dá)到完全聚合，對(duì)照組約60h完全聚合，實(shí)驗(yàn)組包埋塊手工修塊時(shí)硬度和韌性較強(qiáng)，半薄切片平整、無擠壓，容易切出大面積半薄切片;超薄連續(xù)切片厚度均勻，切片完整，無空洞、無震顫;切片能經(jīng)受較長時(shí)間的電子束照射，不易被電子束轟擊損壞。

超微結(jié)構(gòu) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腎組織超薄切片經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛常規(guī)雙染色后圖像反差良好，實(shí)驗(yàn)組腎組織、細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)顯示清晰，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存良好，腎小管微絨毛結(jié)構(gòu)清晰。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組超微結(jié)構(gòu)圖像對(duì)比清晰，染色效果良好，細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)保存良好，膜性細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體質(zhì)膜保持完整，細(xì)胞核膜、線粒體雙層膜及嵴結(jié)構(gòu)顯示清晰(圖1)。

電子致密物反差 我們觀察了LN、MN、IgAN患者的電子致密物沉積情況，實(shí)驗(yàn)組LN-IV型腎小球內(nèi)皮下大量高密度的電子致密物顯示高反差，對(duì)照組電子致密物反差低于實(shí)驗(yàn)組;實(shí)驗(yàn)組MN腎小球基膜上皮側(cè)內(nèi)的電子致密物沉積部位以及與周邊的界限顯示清楚，密度不均一的電子透亮區(qū)較好地顯示電子致密物的吸收程度(圖2A、B)，IgAN系膜區(qū)密度增高的電子致密物沉積顯示清晰(圖2C、D)。實(shí)驗(yàn)組電子致密物對(duì)比反差較強(qiáng)，顯示效果優(yōu)于對(duì)照組，較好地反映出LN、MN、IgAN電鏡下組織學(xué)特點(diǎn)。

圖1 Eponate 12包埋的腎組織超微結(jié)構(gòu)(EM)

圖2 Eponate 12包埋的腎小球電子致密物(EM)

討 論

完整的腎活檢病理診斷包括光鏡、免疫熒光及電鏡診斷，然而，由于腎活檢組織電鏡需經(jīng)過固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、切片、染色，整個(gè)標(biāo)本處理過程細(xì)致、復(fù)雜，耗時(shí)冗長往往不能滿足臨床需要。

目前國內(nèi)較常使用的Epon 812包埋劑聚合時(shí)間長，組織從處理到染色整個(gè)過程大約需要5～7d，整個(gè)制片周期耗時(shí)較長，造成電鏡報(bào)告遠(yuǎn)滯后于光鏡及免疫熒光，一些腎臟疾病診斷必須依賴電鏡如薄基膜腎病、Alport綜合征、Fabry病、致密物沉積病等，因此電鏡觀察滯后往往影響腎臟疾病的診斷和治療。

Eponate 12作為一種黏度低、滲透快、聚合時(shí)間短的電鏡包埋劑，在腎活檢電鏡樣品制備應(yīng)用中，標(biāo)本上午取材固定，下午完成脫水浸透，利用晚上12～16h的時(shí)間完成聚合，最快次日即可切片染色至鏡下觀察，制片過程縮短至2～3d內(nèi)完成，電鏡報(bào)告甚至可以和光鏡、免疫熒光報(bào)告同步發(fā)出，臨床醫(yī)師在患者出院前即可獲得電鏡病理診斷報(bào)告，這對(duì)腎臟疾病的診斷和治療具有重大意義。

Epon 812是電鏡技術(shù)上使用最廣泛的環(huán)氧樹脂類包埋劑，25℃時(shí)其黏度150～200 cPa，完全聚合時(shí)間需要 60h［2-6］，Eponate 12 作為 Epon 812 的替代包埋劑，其黏度為15～21 cPa［7］，我們的研究也發(fā)現(xiàn)其黏度低，配成混合包埋劑后，滲透組織中速度更快，包埋劑聚合時(shí)間短，包埋塊的切割性能、切片的染色反差及超微結(jié)構(gòu)的保存與Epon 812幾乎相同，在電子致密物顯示方面更清晰，圖像反差更好，在膜性結(jié)構(gòu)、電子致密物的觀察方面更具優(yōu)勢(shì)。

隨著電鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，低黏度包埋劑在快速電鏡制樣技術(shù)中應(yīng)用越來越廣，Em Bed 812、Polar Bed 812、Polv Bed 812、spurr、ponate 12 等都屬于低黏度包埋劑，其浸透好，經(jīng)得住電子束照射，整個(gè)包埋過程可在一天內(nèi)完成［8］，在其他種類眾多的環(huán)氧樹脂類包埋劑中，spurr樹脂(ERL 4206)黏度最低，僅為7.18cPa，混合后的包埋劑黏度也只有60cPa，聚合時(shí)間更短，70℃烤箱中8h完全聚合，因而在快速電鏡制樣技術(shù)應(yīng)用較廣，但缺點(diǎn)是毒性大并具有致癌性［9］，限制了其在臨床上廣泛應(yīng)用。Eponate 12的黏度介于Epon 812和spurr之間，在組織各成分中的浸透速度適中，較少出現(xiàn)因包埋塊聚合不均而造成染色不佳的問題，使其成為低黏度包埋劑中一種較好的選擇。同其他包埋劑一樣，Eponate 12配方有多種，固化劑NMA與DDSA的比例決定聚合塊的硬度，其比例可參照經(jīng)典的Luft公式計(jì)算［10］。聚合塊太硬或太軟均不利于修塊和切片，如配方不適合應(yīng)及時(shí)調(diào)整，在實(shí)際工作時(shí) Luft配方中“HARD”配制的包埋塊硬度和韌性適中，容易獲得銀白色的超薄切片，切片染色效果滿意，加速劑DMP-30的濃度應(yīng)控制在1.5% ～2%之間，其用量會(huì)直接影響聚合時(shí)間，濃度增加雖然可以加快單體間的聚合反應(yīng)，但混合后的包埋劑黏度增加不利于充分浸透，包埋塊在切片時(shí)表面容易出現(xiàn)空洞和顫痕，嚴(yán)重影響制片質(zhì)量。在實(shí)際工作中腎組織包埋塊在純包埋劑浸透3h后直接放置60℃烤箱聚合過夜(12～16h)，硬度完全達(dá)到半薄和超薄切片的要求。此外商品化的Eponate 12試劑與Epon 812價(jià)格相差不大，并不增加標(biāo)本前期處理成本，具有很好的經(jīng)濟(jì)性。

Eponate 12包埋劑在腎活檢電鏡樣品制備過程中取得較滿意的效果，特別是顯著縮短腎活檢病理電鏡標(biāo)本制作時(shí)間，切片超微結(jié)構(gòu)好和電子致密物反差明顯在電鏡的快速診斷方面，具有很大的實(shí)用價(jià)值。在腎活檢電鏡技術(shù)中，Eponate 12不失為Epon 812的理想替代包埋劑，能夠更好適應(yīng)臨床診斷對(duì)電鏡技術(shù)的要求。

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