地榆微波滅菌的研究探討

王彩英

（溧陽市人民醫(yī)院，江蘇 溧陽 213300）

本品為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長葉地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia（Bert）Yu et Li的干燥根，前者主產(chǎn)南北各地，后者習(xí)稱“綿地榆”［1］，主產(chǎn)于安徽、浙江、江蘇、江西等地。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品。其性微寒，味苦、酸、澀，歸肝、大腸經(jīng)，具有涼血止血、解毒斂瘡的功效，用于便血痔血、水火燙傷、血痢崩漏、癰腫瘡毒等癥。地榆根中含有多種苷類及酚酸類化合物，而鞣質(zhì)為地榆止血的主要成分。近年來，有關(guān)地榆皂苷及黃酮類成分的研究漸多，亦發(fā)現(xiàn)了一些新的藥理作用，如抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫等，這些都有助于開辟地榆的臨床新用途。地榆在試管內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌以及白喉、痢疾、大腸、傷寒、副傷寒、綠膿、人型結(jié)核等桿菌都有抑制作用，對(duì)某些致病真菌也有不同程度的抑制作用［2］。本文旨在通過薄膜過濾法［3］，消除地榆抗菌成分對(duì)微波滅菌效果的結(jié)果觀察，結(jié)合姚遠(yuǎn)［4］、應(yīng)月青［5］、梁霞［6］等人的文獻(xiàn)綜述，論證微波滅菌對(duì)于醫(yī)院制劑原材料滅菌的可行性，并通過多次實(shí)驗(yàn)尋求最佳滅菌效果所需要的各項(xiàng)條件。

1 試藥與樣品

1.1 藥材

地榆：購于溧陽市醫(yī)藥公司，產(chǎn)品批號(hào)：2010080，安徽海鑫中藥飲片有限公司出品。

1.2 儀器

微波滅菌機(jī)：WG－5，5000W （山東省青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司）；300g搖擺式高速萬能粉粹機(jī)：DFY－300，1000W（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；馬頭牌JYT－5架盤藥物天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱：G2X－DH·400－BS－Ⅱ，800W （上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱：HH·BII·420－BY－Ⅱ，400W （上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；霉菌培養(yǎng)箱：MJ－160B－Ⅱ，200W（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；立式滅菌機(jī)：LMQ·C51L，1200W（山東新華器械醫(yī)療股份有限公司）；菌落計(jì)數(shù)器：XK97－A（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 試液、稀釋劑以及培養(yǎng)基

pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；膽鹽乳糖增菌液；膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基；MUG培養(yǎng)基；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；改良馬丁培養(yǎng)基；改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基。

1.5 實(shí)驗(yàn)用菌株

大腸埃希菌 （Escherichia coli）：［CMCC（B）44102］；金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）：［CMCC（B）26003］；枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis）：［CMCC（B）63501］；白色念珠菌（Candida albicans）：［CMCC（F）98001］；黑曲霉（Aspergillus niger）：［CMCC（F）98003］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 微波滅菌

在無菌條件下，取地榆飲片6份，3份用純化水噴淋至微濕，另3份不經(jīng)噴淋直接置于干燥板上滅菌，在同樣的環(huán)境下微波滅菌，做三組平行試驗(yàn)。取地榆飲片2份，一份打粉后置于微波滅菌機(jī)中滅菌10min，一份原片置于微波滅菌機(jī)中滅菌12min。分別多點(diǎn)取樣，留用觀察。在無菌環(huán)境下，先用純化水將所需實(shí)驗(yàn)用地榆飲片淋濕，使其達(dá)到一定含水量，以保證最佳滅菌效果［7］。將噴淋的地榆飲片均勻鋪于微波滅菌板上，厚度約0.5cm。調(diào)節(jié)微波滅菌機(jī)滅菌波段，我們選擇PP01機(jī)組，使用微波滅菌機(jī)總功率的1／3，滅菌溫度控制在75℃～85℃，分別滅菌7、8、9、10、11、12、13、14、15、16min。

2.2 供試品制備

將滅菌后的地榆飲片置于300g搖擺式高速萬能粉粹機(jī)中粉碎成細(xì)粉。取樣品適量，放于無菌一次性培養(yǎng)皿中備用。

2.3 無菌檢查方法驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)菌種及菌液制備

取各菌濃培養(yǎng)液，按1mL→9mL pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液的10倍稀釋法，制成含菌50～100cfu／mL的供試菌液。

2.3.2 薄膜過濾法驗(yàn)證

①試驗(yàn)組：將規(guī)定量的地榆供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100cfu的試驗(yàn)菌，過濾，取出濾膜接種至改良馬丁培養(yǎng)基中；②對(duì)照組：另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。按規(guī)定培養(yǎng)3～5d，各試驗(yàn)菌同法操作。

結(jié)果判斷：使用薄膜過濾法的供試品容器中的試驗(yàn)菌生長良好，則供試品地榆粉末的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無菌檢查。故宜采用薄膜過濾法檢查微生物限度。

2.3.3 菌落計(jì)數(shù)的驗(yàn)證

①試驗(yàn)組：薄膜過濾法計(jì)數(shù)：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，過濾，取出濾膜，菌面朝上貼在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或者玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上置相應(yīng)的溫度培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間。②菌液組：分別測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)，菌—＞平皿；③供試品對(duì)照組：取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)（即供試品的本底菌數(shù)）；④稀釋劑對(duì)照組：用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1mL供試液含50～100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。

回收率計(jì)算：①試驗(yàn)組：（試驗(yàn)組－供試品組）／菌液組×100%

②稀釋劑組：稀釋劑組／菌液組×100%

表1 薄膜過濾法菌回收率

結(jié)果判斷：在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率和試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，說明薄膜過濾法計(jì)數(shù)可行。

2.3.4 控制菌檢查方法驗(yàn)證

程序：（預(yù)增菌培養(yǎng)）增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→純培養(yǎng)→革蘭染色鏡檢、生化反應(yīng)。①試驗(yàn)組：取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中；②陰性菌對(duì)照組：供試液＋陰性菌，同試驗(yàn)組——驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專屬性［10］；③陰性對(duì)照菌株：金黃色葡萄球菌——驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌；大腸埃希菌——驗(yàn)證金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、梭菌檢查。

2.4 微生物限度檢查法

2.4.1 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基以及器材消毒滅菌

將配制好的pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖增菌液、膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、PYD培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基分別放于相應(yīng)錐形瓶或試管中，瓶口或管口用滅菌塞子塞好，并用布扎好，于立式滅菌機(jī)中121℃消毒滅菌1h。玻璃培養(yǎng)皿罐裝于帶蓋不銹鋼桶，置于恒溫干燥箱中160℃滅菌120min。

2.4.2 供試品溶液配制

精密稱取滅菌后的地榆10g至200mL錐形瓶，加pH 7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，配成1：10供試液。

2.4.3 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)

（1）10倍遞增稀釋試驗(yàn)組。用一次性無菌注射器吸取1：10供試液1mL，均勻經(jīng)濾膜濾過，再用不少于100mL pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液溶液沖洗濾膜，用鑷子將濾膜取出，菌面朝上貼于無菌雙碟底部。另取1mL供試液，注入9mLpH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液，配成1：100稀釋級(jí)供試液，同法制備四個(gè)碟子。再取1：100稀釋級(jí)供試液1mL配成1：1000稀釋級(jí)，同法再制備四個(gè)碟子。每一稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少注2個(gè)平皿。

（2）陰性對(duì)照。待各級(jí)稀釋液注皿完畢后，用1支1mL針管吸取稀釋劑（pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液）各1mL，分別注入四個(gè)平皿中。其中兩個(gè)作細(xì)菌陰性對(duì)照，兩個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對(duì)照。另外準(zhǔn)備兩個(gè)無菌空平皿作培養(yǎng)基空白。

（3）傾注培養(yǎng)基。將預(yù)先配制好的細(xì)菌計(jì)數(shù)用的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)用的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基和YPD瓊脂培養(yǎng)基熔化，冷卻至約45℃時(shí)，傾注上述各個(gè)平皿約15mL，以順時(shí)針或逆時(shí)針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿，使供試液或稀釋液與培養(yǎng)基混勻，蓋上陶瓦蓋，置操作平臺(tái)上待凝。

（4）培養(yǎng)。細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于32℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板倒置于25℃、相對(duì)濕度75%霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

（5）菌落計(jì)數(shù)。將培養(yǎng)好的平皿放置于菌落計(jì)數(shù)器上或從平板背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。盡量不漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)及平皿邊緣生長的菌落。并注意與地榆供試品粉末顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡的鑒別。必要時(shí)，用放大鏡或低倍顯微鏡直接觀察。菌落極小不易辨認(rèn)的延長培養(yǎng)時(shí)間到5d。

2.4.4 控制菌檢查——大腸埃希菌

（1）薄膜過濾法。用一次性無菌注射器吸取供試液10mL，注入稀釋劑100mL中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑45mm，孔徑0.45μm微孔濾膜的薄膜過濾器中，過濾，用稀釋劑沖洗濾膜，不少于100mL，用鑷子取出濾膜，加入預(yù)先配制好的100mL膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)基中。另一份100mL膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基中加入等量稀釋劑作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18～24h，必要時(shí)延長到48h。取上述培養(yǎng)物0.2mL，接種至含5mLMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24h在366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。觀察后，沿培養(yǎng)基的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液。液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照的MUG和靛基質(zhì)應(yīng)為陰性。如MUG陽性，靛基質(zhì)陽性，判斷檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。如呈現(xiàn)MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時(shí)，應(yīng)將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18～24h。若平板上無菌落生長、或生長菌落與菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。

（2）結(jié)果及結(jié)論。在紫外光下管內(nèi)培養(yǎng)物不呈現(xiàn)熒光，MUG陰性。加入靛基質(zhì)試液后，液面呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。判斷地榆粉末供試品中未檢出大腸埃希菌［8］。

2.4.5 大腸菌群

（1）增菌培養(yǎng)。取不少于10mL膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，加入1：10供試液1mL（含供試品0.1g）；1：100稀釋的供試液1mL（含供試品0.01g）和1：1000稀釋的供試液1mL（含供試品0.001g）。取2支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基10mL管，一支加入稀釋劑1mL作為陰性對(duì)照，一支不加作為培養(yǎng)基空白對(duì)照。均培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。加供試液的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管中無菌生長或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則判斷該管未檢出大腸菌群，若膽鹽乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)進(jìn)一步分離培養(yǎng)。

（2）分離培養(yǎng)。將上述產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中的培養(yǎng)物，分別劃線接種于曙紅亞甲蘭瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24h。若平板上無菌落生長，或生長的菌落與特征不符或?yàn)榉歉裉m陰性無芽孢桿菌，判斷未檢出大腸菌群；若平板上生長有菌落形態(tài)特征菌或者疑似菌落，且為格蘭陰性芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。

（3）確證實(shí)驗(yàn)。從上述分離平板上挑出4～5個(gè)疑似菌落，接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24～48h。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判斷膽鹽乳糖發(fā)酵管中檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。

表2 地榆飲片干片與濕片微波滅菌效果比較

表3 不同工藝程序?qū)缇Ч挠绊?/p>

表4 微波滅菌不同時(shí)間效果

3 結(jié)果與討論

在實(shí)驗(yàn)過程中，不斷摸索最佳滅菌條件，經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)地榆的滅菌溫度控制在75℃～85℃是比較合適的，在此溫度下，比較容易控制時(shí)間，不會(huì)因?yàn)樯郎剡^快導(dǎo)致地榆炭化等問題促使試驗(yàn)失敗。我們采用頻率2450MHz，功率0～3kW 的連續(xù)高功率微波［12］，對(duì)干濕狀態(tài)的細(xì)菌進(jìn)行不同強(qiáng)度及時(shí)間的輻照，比較其殺滅率。實(shí)驗(yàn)顯示：不同強(qiáng)度及輻照時(shí)間的微波對(duì)干菌作用后，其溫度無顯著變化，但活菌數(shù)顯著減少；對(duì)濕菌的殺滅效果顯著高于干菌。已有文獻(xiàn)資料顯示含水量對(duì)殺菌效果影響較大，當(dāng)含濕率≤25%時(shí)，含濕率越高，殺菌效果越好［11］。所以以后醫(yī)院在制劑原材料滅菌方面，我們推薦用純化水將藥材噴淋后滅菌打粉入藥。

對(duì)于先滅菌還是先打粉的問題，通過實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)先打粉后滅菌的地榆飲片的滅菌效果雖然不錯(cuò)，但差異很大，且滅菌溫度不易控制，在滅菌12min后，粉狀地榆多處出現(xiàn)炭化現(xiàn)象。故建議醫(yī)院制劑進(jìn)行原藥材滅菌時(shí)，采取先滅菌后打粉的方法。地榆的微波滅菌，隨著滅菌時(shí)間的增長，滅菌效果變化較大，滅菌7min，微生物檢查不合格，8min接近合格，在15min達(dá)到最佳滅菌效果，到達(dá)16min后，地榆飲片在微波滅菌過程中局部出現(xiàn)炭化現(xiàn)象。因此，地榆的最佳滅菌時(shí)間段為9～16min。

微波是實(shí)現(xiàn)安全、可靠、高效滅菌的一種方法，只要時(shí)間和溫度控制得當(dāng)，就能達(dá)到很好的滅菌效果。但微波對(duì)不同藥材和菌種的滅菌，還需通過實(shí)驗(yàn)摸索具體的滅菌條件，對(duì)特殊的使用條件須設(shè)計(jì)相應(yīng)的微波設(shè)備，對(duì)微波滅菌機(jī)理的解釋仍存在很多疑問，這將是該領(lǐng)域今后研發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：117－118.

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