ABCA1基因啟動(dòng)子區(qū)域VNTR-ZNF位點(diǎn)多態(tài)性及與血漿HDL水平的關(guān)系

高慎霞 毛用敏 陳 倩 趙莉莉 崔讓莊

血漿高密度脂蛋白（HDL）水平降低是冠心?。–HD）發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[1]。腺苷三磷酸（ATP）結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP-binding cassette trans?porter A1，ABCA1）在啟動(dòng)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)和HDL生成起始階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。ABCA1基因序列中某些核苷酸變異可改變其活性并影響HDL水平[3]。ABCA1基因啟動(dòng)子區(qū)域有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的作用元件，其中-220 bp附近區(qū)域?yàn)閆NF202的結(jié)合位點(diǎn)，此處有一個(gè)同向重復(fù)序列可變數(shù)（variable number of tandem repeats，VNTR）多態(tài)位點(diǎn)，為ACCCC插入缺失變異（VNTR-ZNF）。本研究旨在對(duì)ABCA1基因啟動(dòng)子區(qū)域VNTR-ZNF位點(diǎn)插入/缺失多態(tài)性進(jìn)行觀察并探討其與血漿HDL水平的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)抽取天津市胸科醫(yī)院2007年9月—2009年4月住院的心肌梗死患者（按照WHO1979年診斷標(biāo)準(zhǔn)）166例（CHD組），其中男116例，女50例，平均年齡（56.2±9.7）歲，均有持續(xù)性胸骨后劇烈疼痛，血清心肌酶升高及心電圖ST-T變化。對(duì)照組99例，為同期本單位健康體檢者，其中男71例，女28例，平均年齡（51.9±7.4）歲。

1.2 方法 （ 1）基因組DNA制備采用Triton低滲緩沖液溶血法從白細(xì)胞中提取。（2）PCR擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[4]，上游引物：5′-CCC TAA GAC ACC TGC TGT ACCC-3；′下游引物：5′-CTG AGA ACC GGC TCT GTT GGT-3′。PCR（擴(kuò)增體系反應(yīng)體積為25 μL。各成分終濃度分別為：Tris-HCl 60 mmol/L，（NH4）2SO415 mmol/L，pH 9.5，MgCl22.5 mmol/L，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.2 mmol/L，引物各0.4 μmol/L，Taq酶 2 .5 U，模板DNA 0.5 μg。循環(huán)溫度：95℃5 min變性；95℃ 3 0 s、62℃ 3 0 s、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。（3）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離基因型，用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。（4）血脂測(cè)定：HDL及HDL亞組采用PEG20000進(jìn)行沉淀去除低密度脂蛋白（LDL）和極低密度脂蛋白（VLDL），酶法測(cè)定上清液中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)公式計(jì)算各等位基因頻率，Har?dy-Weinberg公式計(jì)算各基因型（p+q=1，2pq=雜合型基因頻率）的理論值（野生型：樣本總數(shù)×p2；雜合突變：樣本總數(shù)×2pq；純合突變：樣本總數(shù)×q2），χ2檢驗(yàn)檢測(cè)Hardy-Weinberg平衡吻合度。全部數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x ±s表示，對(duì)照組和CHD組基因型頻率及等位基因頻率的比較用χ2檢驗(yàn)，不同基因型HDL水平比較用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型檢測(cè)結(jié)果 PCR擴(kuò)增出ABCA1基因啟動(dòng)子區(qū)域含-220 bp處ACCCC插入和缺失的基因片段，經(jīng)電泳分離，插入型顯示200 bp 1個(gè)條帶，缺失型顯示195 bp 1個(gè)條帶，雜合子顯示200 bp、195 bp 2個(gè)條帶，見(jiàn)圖1。

2.2 Hardy-Weinberg平衡 本研究所選人群群體代表性好（均P>0.05），能反映天津地區(qū)人群的總體情況，見(jiàn)表1。

表12 組ABCA1基因VNTR-ZNF位點(diǎn)多態(tài)基因型實(shí)際值與理論值

2.3 被檢人群基因型和等位基因頻率的分布狀況 CHD組和對(duì)照組基因型頻率和等位基因頻率在2組間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。被檢總?cè)巳旱任换蝾l率分別為插入型31.3%（166/530），缺失型68.7%（364/530）；基因型頻率分別為插入型6.4%（17/265），缺失型43.8%（116/265），插入/缺失型49.8%（132/265）。

表2 2組基因型頻率及等位基因頻率分布

2.4 血漿HDL-C在不同基因型中的水平 CHD組和對(duì)照組2組內(nèi)各基因型間HDL及HDL亞組分水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表3。

表3 2組不同基因型血漿HDL-C水平比較（mmol/L±s）

表3 2組不同基因型血漿HDL-C水平比較（mmol/L±s）

雜合子為插入/缺失型；均P>0.05

插入型雜合子缺失型F n 5 5 1 43 HDL 1.38±0.30 1.26±0.33 1.22±0.27 0.724 HDL2 0.51±0.17 0.49±0.22 0.49±0.19 0.038 HDL3 0.87±0.17 0.77±0.15 0.74±0.15 1.574 n 12 81 73 HDL 0.88±0.27 0.91±0.25 0.92±0.21 0.143 HDL2 0.36±0.16 0.35±0.16 0.35±0.12 0.013 HDL3 0.53±0.13 0.56±0.13 0.57±0.12 0.706對(duì)照組 CHD組基因型

3 討論

ABCA1是參與并啟動(dòng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的重要蛋白[5]。ABCA1位于細(xì)胞膜，有2組跨膜結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)與載脂蛋白（Apo）AⅠ相連。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇增多時(shí)，高爾基體將細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩的膽固醇轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜，通過(guò)ABCA1的胞吐作用被轉(zhuǎn)運(yùn)到HDL中的ApoAⅠ，HDL在接受膽固醇的同時(shí)從新生的盤狀轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓那驙?。ABCA1啟動(dòng)膽固醇的外流對(duì)HDL的成熟和膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)起到了重要的作用。

ABCA1基因位于9號(hào)染色體短臂，包含50個(gè)外顯子和49個(gè)內(nèi)含子。其開(kāi)放閱讀框架由6 783個(gè)核苷酸組成，編碼2 261個(gè)氨基酸。在ABCA1的基因序列中存在眾多的堿基變異，構(gòu)成了不同的基因多態(tài)性。其中一些改變了氨基酸的組成，有些基因變異影響ABCA1的功能，使血漿中HDL水平升高或降低[6]。在ABCA1的啟動(dòng)子區(qū)域也存在一些基因變異，可能會(huì)影響ABCA1的轉(zhuǎn)錄活性，使ABCA1的生成增加或減少，從而影響膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)和HDL的合成[7]。在ABCA1基因啟動(dòng)子-220處存在1個(gè)ACCCC插入/缺失變異，這個(gè)區(qū)域恰是轉(zhuǎn)錄因子ZNF 202的結(jié)合位點(diǎn)，而ZNF 202對(duì)ABCA1的轉(zhuǎn)錄起下調(diào)作用[8]。關(guān)于ACCCC插入/缺失變異是否會(huì)影響ZNF 202與其結(jié)合從而影響血漿HDL水平，目前報(bào)道很少。本研究結(jié)果顯示ACCCC插入型等位基因頻率為31.3%；缺失型等位基因頻率為68.7%。由此產(chǎn)生的插入基因型頻率為6.4%；缺失基因型頻率為43.8%；插入/缺失基因型頻率為49.8%，天津地區(qū)人群這一位點(diǎn)基因型的分布與Probst等[4]報(bào)道的歐洲地區(qū)人群的基因型分布有明顯不同（插入型54.3%，缺失型4.4%，插入/缺失型41.3%），天津地區(qū)插入基因型頻率明顯低于歐洲地區(qū)，缺失基因型頻率明顯高于歐洲地區(qū)，提示這一位點(diǎn)基因變異可能與地區(qū)和種族有關(guān)。

本研究顯示HDL及其亞組分水平在不同基因型之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Probst等[4]報(bào)道高HDL（>1 000 mg/L）者中插入型占70.4%，高于低HDL（<500 mg/L）實(shí)驗(yàn)者（54.4%），和中間HDL[（660±140）mg/L]實(shí)驗(yàn)者（57.2%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此與本研究結(jié)果一致。電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）顯示ACCCC缺失序列DNA片段與核蛋白提取物中的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力強(qiáng)于插入序列，而ZNF 202可下調(diào)ABCA1的轉(zhuǎn)錄活性，故缺失基因型血漿HDL水平可能相對(duì)較低[4]。由于本研究檢測(cè)的樣本數(shù)較少，未發(fā)現(xiàn)基因型之間HDL水平的明顯差異，有待進(jìn)一步研究。

[1]Abbott RD,Wilson PW,Kannel WB,et al.High density lipoprotein cholesterol,total cholesterol screening,and myocardial infarction:The Framingham Study[J].Arteriosclerosis,1988,8(3):207-211.

[2]Jonathan C,Cohen JC,Robert S,et al.Mulitiple rare alleles contrib?ute to low plasma levels of HDL cholesterol[J].Science,2004,305(6):869-872.

[3]Soro-Paavonen A,Naukkarinen J,Lee-Rueckert M,et al.Common ABCA1 variants,HDL levels,and cellular cholesterol efflux in sub?jects with familial low HDL[J].J Lipid Res,2007,48(6):1409-1416.

[4]Probst MC,Thumann H,Aslanidis C,et al.Screening for functional sequence variations and mutations in ABCA1[J].Atherosclerosis,2004,175(2):269-279.

[5]Field J,Watt K,Mathur SN.Origins of intestinalABCA1-mediated HDL-cholesterol[J].J Lipid Res,2008,49(12):2605-2619.

[6]Ergen A,Isbir S,Tekeli A,et al.Investigation ofABCA1 C69T and G-191C polymorphisms in coronary artery disease[J].In Vivo,2008,22(2):187-190.

[7]Kyriakou T,Hodgkinson C,Pontefract DE,et al.Genotypic Effect of the-565C>T polymorphism in the ABCA1 gene promoter on AB?CA1 expression and severity of atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(2):418-423.