纈沙坦對(duì)尼古丁損傷血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的保護(hù)作用及機(jī)制

羅宏麗 張青碧 肖順林 王述蓉

吸煙被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，而尼古丁是煙草中的主要毒性物質(zhì)。因此，尋找有效的藥物來對(duì)抗尼古丁的血管損害作用非常必要。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）和血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑（ARB）是有效的且耐受性良好的降壓藥，已被廣泛用于防治心血管疾病。筆者前期實(shí)驗(yàn)研究表明ACEI能通過清除氧自由基改善尼古丁對(duì)血管內(nèi)皮的損傷[1]。本研究擬探討ARB纈沙坦對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能損害的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動(dòng)物。普通級(jí)SD大鼠28只，雌雄不拘，體質(zhì)量220~250 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：陜動(dòng)證字08-004。（2）儀器。PowerLab數(shù)據(jù)記錄和分析系統(tǒng)，包括軟件Chart 5.0以及硬件8通道橋式放大器（ADInstruments Co，澳大利亞），F(xiàn)T03C?張力換能器（Grass In?strument Co.Quincy，Mass,美國(guó)）；Myograph?恒溫器官浴漕（DMT，丹麥）；YH·YX-11型浮標(biāo)式氧氣吸入器，上海醫(yī)療器械廠；XTZ-E型連續(xù)變倍體視顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；DH2500型電熱恒溫培養(yǎng)箱等。（3）試藥。尼古丁、氯化乙酰膽堿（ACh）、L-Nω-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、吲哚美辛（Indo）、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；纈沙坦購(gòu)自天大藥業(yè)有限公司；DMEM培養(yǎng)基為西安華美生物工程公司產(chǎn)品。除吲哚美辛先用DMSO初溶，其余均用Krebs液溶解，所有試劑使用前用Krebs液稀釋。

1.2 標(biāo)本制作 SD大鼠斷頭處死，迅速取出腸系膜上動(dòng)脈，浸入冷的Krebs液中，顯微鏡下剝除外膜脂肪及部分結(jié)締組織，剪成長(zhǎng)約1 mm的血管環(huán)。Krebs液組成（mmol/L）：NaCl 119、NaHCO315、KCl 4.6、MgCl21.2、NaH2PO41.2、CaCl21.5和葡萄糖5.6。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及血管培養(yǎng) 將制備好的血管環(huán)放入盛有2 mL DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放3~4段，并將血管環(huán)分為以下7個(gè)組。（1）空白對(duì)照組（C組）：加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的0.9%氯化鈉注射液。（2）尼古丁組（N組）：加入0.1 mmol/L尼古丁。（3）纈沙坦低、中、高劑量組（V1、V2、V3組）：先分別加入0.1、1、10 μmol/L纈沙坦，再加入0.1 mmol/L尼古丁。（4）L-NAME組（L組）或吲哚美辛組（I組）：先分別加入L-NAME（100 μmol/L）或Indo（10 μmol/L），再加入尼古?。?.1 mmol/L）和纈沙坦（10 μmol/L）。各組血管環(huán)加完藥物之后置37℃恒溫培養(yǎng)箱，充以95%O2和5%CO2混和氣體，培養(yǎng)24 h后取出。配好的DMEM培養(yǎng)基臨用前加入L-谷氨酸584 mg/L、青霉素105U/L、鏈霉素100 mg/L。

1.4 血管張力實(shí)驗(yàn) 血 管環(huán)培養(yǎng)24 h后取出，檢測(cè)其張力。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)脈環(huán)靜息負(fù)荷2 mN，每20 min換液1次，穩(wěn)定1.5 h。然后以K+-Krebs液（含K+60 mmol/L）檢驗(yàn)動(dòng)脈環(huán)收縮性，2次收縮幅度相差<10%者用于實(shí)驗(yàn)。K+-Krebs液組成為（mmol/L）：NaCl 60、NaHCO315、KCl 63.5、MgCl21.2、NaH2PO41.2、CaCl21.5和葡萄糖5.5。先用1 μmol/L去甲腎上腺素(NE)預(yù)收縮，待張力上升并穩(wěn)定后，加入累積濃度（10-9~10-6mol/L）的乙酰膽堿（ACh）舒張血管，檢測(cè)內(nèi)皮功能。以NE誘發(fā)的最大穩(wěn)定收縮幅度為100%，ACh誘發(fā)的舒張幅度與NE誘發(fā)的最大穩(wěn)定收縮幅度之比為血管的舒張率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn) 用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

表1 各組血管舒張率的比較 （n=8，%±s）

表1 各組血管舒張率的比較 （n=8，%±s）

logC為ACh濃度取對(duì)數(shù)值；**P<0.01

C組N組V1組V2組V3組I組L組F P C∶N N∶V1 N∶V2 N∶V3 V3∶I V3∶L-9 8.25±4.66 1.45±3.15 1.08±0.72 1.84±0.21 4.25±0.57 2.04±0.13 2.12±0.13 10.952**<0.001 0.734 0.718 0.013 0.046 0.054-8.5 19.44±9.28 5.78±4.50 6.23±0.93 9.56±4.03 14.36±1.93 8.53±1.03 7.43±1.03 10.750**<0.001 0.837 0.085<0.001 0.009 0.002-8 36.14±8.35 14.08±8.51 15.67±2.59 23.76±1.59 29.12±2.38 22.97±1.59 18.97±2.04 20.542**<0.001 0.515<0.001<0.001 0.014<0.001-7.5 55.23±11.37 25.70±5.89 28.36±3.05 35.18±4.34 41.02±4.63 34.43±3.72 30.51±2.03 23.896**<0.001 0.359 0.002<0.001 0.026 0.001-7 73.63±10.68 36.09±7.15 40.23±3.21 49.31±5.42 56.37±6.06 50.87±3.97 40.93±3.07 33.993**<0.001 0.186<0.001<0.001 0.081<0.001-6.5 88.11±7.39 48.94±7.31 53.68±5.01 65.75±5.96 73.27±7.75 60.76±5.37 55.32±5.26 35.646**<0.001 0.144<0.001<0.001<0.001<0.001-6 95.62±3.72 58.71±8.56 62.43±6.83 74.81±6.20 85.61±5.04 73.45±6.43 66.75±5.38 35.658**<0.001 0.235<0.001<0.001<0.001<0.001組別logC

2 結(jié)果

血管環(huán)與尼古丁共同培養(yǎng)24 h后，對(duì)ACh產(chǎn)生的最大舒張率顯著低于空白對(duì)照組（P<0.01），而除V2組logC為-9、-8.5外，中、高劑量的纈沙坦（V2、V3組）能明顯降低尼古丁對(duì)血管環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)的抑制（P<0.05或P<0.01）。除L組logC為-9外，與V3組比較，I組和L組均能使纈沙坦的保護(hù)作用明顯降低，即ACh產(chǎn)生的最大舒張率顯著降低，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

3 討論

內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)降低是血管內(nèi)皮功能不全的主要表現(xiàn)，也是動(dòng)脈粥樣硬化早期的特征性改變，而且對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展及并發(fā)癥（如血管痙攣、血栓形成）有重要影響。既往研究發(fā)現(xiàn)，ARB纈沙坦在平穩(wěn)降壓的同時(shí)，能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能[2]。乙酰膽堿誘導(dǎo)血管內(nèi)皮釋放的內(nèi)皮依賴性舒張因子主要有一氧化氮（NO）、前列環(huán)素（PGI2）和內(nèi)皮依賴性超極化因子（EDHF）3種。NO和PGI2既是反映內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要指標(biāo)，又是內(nèi)皮細(xì)胞自我抗損傷的內(nèi)源性保護(hù)因子，二者均具有消除氧自由基和抗氧化損傷的功能。

本研究顯示纈沙坦能明顯對(duì)抗尼古丁所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的降低，且這一作用可被一氧化氮合酶抑制劑L-NAME和環(huán)氧酶抑制劑吲哚美辛所阻斷，提示纈沙坦的保護(hù)作用與其保護(hù)血管內(nèi)皮釋放小分子活性物質(zhì)NO和PGI2有關(guān)，初步說明NO/一氧化氮合酶（NOS）和環(huán)氧酶2條途徑均參與纈沙坦的血管內(nèi)皮保護(hù)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，上述2條途徑分別由環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）介導(dǎo)，同時(shí)又存在相互作用[3]。纈沙坦調(diào)節(jié)這2條信號(hào)通路的詳細(xì)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)僅局限在NO和PGI2途徑，EDHF是否參與，或是否還有其他的機(jī)制，尚有待于進(jìn)一步研究。本研究為動(dòng)物離體實(shí)驗(yàn)，今后將進(jìn)一步前瞻性的開展長(zhǎng)期吸煙者的臨床研究，使纈沙坦在預(yù)防、治療由吸煙引起的心血管疾病中發(fā)揮主要作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，高血壓患者和健康志愿者分別單次予以纈沙坦160 mg、80 mg口服，服藥后24 h血藥濃度分別為457.8 μg/L、1 800 μg/L[4-5]。本實(shí)驗(yàn)中所采用纈沙坦的濃度為0.1~10 μmol/L，其中高濃度10 μmol/L遠(yuǎn)高于人體血藥濃度（1 μmol/L），但纈沙坦作用時(shí)間短，血管僅培養(yǎng)24 h，并且此濃度也與另外一些離體實(shí)驗(yàn)采用的劑量相一致[6-7]，因此本研究中所采用的纈沙坦?jié)舛冗€是比較合理的。

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