生物復合型破乳劑破乳特性研究

徐 暘，馬 放，代 陽，李 旭，劉 暢

(1．哈爾濱工業(yè)大學 城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱，mafang@hit．edu．cn;2．哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，150090哈爾濱)

生物復合型破乳劑破乳特性研究

徐 暘1，2，馬 放1，2，代 陽1，2，李 旭1，2，劉 暢1，2

(1．哈爾濱工業(yè)大學 城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱，mafang@hit．edu．cn;2．哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，150090哈爾濱)

為解決現(xiàn)有生物破乳劑破乳效率低、穩(wěn)定性差、易受環(huán)境影響、難以大規(guī)模生產(chǎn)的問題，將具有破乳效果的莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)在改進的無機鹽液體培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)，得到了一種高效生物復合型破乳劑．生物復合型破乳劑全培養(yǎng)液在室溫下，接觸時間48 h可使O/W型模型乳狀液完全破乳．與單一菌株的全培養(yǎng)液相比，縮短了發(fā)酵時間(提高6 h以上)，降低了破乳劑投加量，提升了破乳活性和穩(wěn)定性．乳狀液pH值為3～7的條件下，生物復合型破乳劑可維持較高破乳活性．具有良好耐溫性，乳狀液溫度在20～120℃，破乳劑排油率變化在15%以內(nèi)．復合后，生物破乳劑仍主要依靠發(fā)酵過程中產(chǎn)生代謝產(chǎn)物破乳，上清液排油效果為全培養(yǎng)液的87%，菌體懸液幾乎不具有破乳活性．與目前廣泛使用的化學破乳劑相比，對大慶油田含油廢水的處理效果基本接近．微生物破乳劑的復合是提高破乳活性的有效手段．

生物復合型破乳劑;全培養(yǎng)液;乳狀液;排油率

破乳劑在原油生產(chǎn)、運輸以及油污分離、去除等領(lǐng)域具有重要的作用．長期以來工業(yè)中主要使用化學破乳劑進行油水分離［1－2］．然而，化學破乳劑表現(xiàn)出較強的專一性，且會將大量無機鹽或有機殘留物帶進原油廢水中．排放含有化學殘留物的廢水會對環(huán)境造成嚴重危害，對這樣的廢水進行處理又會大大提高生產(chǎn)成本．生物破乳技術(shù)利用微生物細胞本身或者其代謝過程、代謝產(chǎn)物實現(xiàn)乳狀液破乳，具有生產(chǎn)工藝簡單，能耗小的優(yōu)點［3－7］．更重要的是，生物破乳劑無毒、易被降解，其環(huán)保性是化學破乳劑無法比擬的．

但是，生物破乳劑的破乳效率低，穩(wěn)定性較差，而且生產(chǎn)成本偏高，制約了其大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用［8］．對生物破乳劑進行復配，提高生物破乳劑的破乳能力和穩(wěn)定性，將成為生物破乳劑研發(fā)的重要方向之一．有研究者將生物破乳劑與化學破乳劑進行復配［9－11］，利用二者間的協(xié)同作用提高破乳效果．但仍然無法從根本上解決化學破乳劑對環(huán)境的污染問題．枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)是目前研究較多、破乳效果較好的生物破 乳 菌［12－13］．莫 海 威 芽 孢 桿 菌 (Bacillus mojavensis)是本實驗室從大慶油田含油土壤中分離出的破乳優(yōu)勢菌［14］．研究表明這兩株破乳菌均為利用代謝產(chǎn)物破乳．將這兩株破乳機制相似的菌株進行有效的復合，可以克服使用單一菌體培養(yǎng)液破乳效果不佳，與化學破乳劑復配仍有污染物殘留的不足，具有廣闊的應(yīng)用前景．

1 實驗

1.1 菌種來源

莫海威芽孢桿菌(Bacillus mojavensis)從大慶油田長期被污染的土壤中篩選獲得，見文獻［15］．枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)來自本實驗室．

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

文中的培養(yǎng)基均為改進的無機鹽液體培養(yǎng)基(MMSM)．培 養(yǎng) 基 組 成 (g/L):NH4NO33. 0，K2HPO43. 0，KH2PO44. 0，MgSO4·H2O 0. 1，酵母膏0. 5，葡萄糖10. 0，微量元素溶液5 mL，液體石蠟4%．微量元素溶液組成(g/L):CaCl2·2H2O 1. 0，F(xiàn)eSO4·7H2O 1. 0，EDTA 1.4．

1.2.2 培養(yǎng)條件

將莫海威芽孢桿菌接種于MMSM液體培養(yǎng)基中，在28～32℃、搖床轉(zhuǎn)數(shù)140 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，得莫海威芽孢桿菌種子液(種子液1)．

將枯草芽胞桿菌接種于MMSM液體培養(yǎng)基中，在28～32℃、搖床轉(zhuǎn)數(shù)140 r/min的條件下培養(yǎng)20 h，得枯草芽胞桿菌種子液(種子液2)．

將3～5 mL的種子液1與1.5～3.0 mL的種子液2分別接種于100 mL的MMSM液體培養(yǎng)基中，在32～35℃、搖床轉(zhuǎn)數(shù)為80～160 r/min、pH值為7～8的條件下培養(yǎng)10～16 h，即得生物復合型破乳劑．

1.3 破乳能力測定方法

1.3.1 O/W乳狀液的制備

0.028%(體積分數(shù))Span 60－煤油與0.072%(體積分數(shù))TWEEN 60－水的原液以體積比 3.5∶6.5混合．采用乳化剪切機以5 000 r/min轉(zhuǎn)速攪拌3 min得到乳狀液．經(jīng)油紅染色法鑒定，該乳狀液為O/W型乳狀液，穩(wěn)定時間超過200 h．

1.3.2 破乳能力測定

除特殊說明，破乳能力的測試方法為:取2.5 mL的細菌全培養(yǎng)液加入到5 mL乳狀液中，震蕩混勻后置于室溫下破乳．48 h后，使用針管吸出排出的油．依據(jù)破乳后排出油的體積與乳狀液中油體積的比值計算排油率，即排油率(%)=排出油的體積/乳狀液中油體積．

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)時間對破乳特性的影響

采用分光光度法在620 nm波長條件下測定不同培養(yǎng)時間生物復合型破乳劑全培養(yǎng)液的OD值，同時測定不同培養(yǎng)時間時全培養(yǎng)液對模型乳狀液的破乳效果．結(jié)果如圖1所示．

圖1 生物復合破乳劑生長曲線及破乳效果

復合破乳菌混合培養(yǎng)4 h后開始進入對數(shù)生長期，在此時期細菌數(shù)量按幾何級數(shù)增長，菌量迅速上升，22 h以后進入生長穩(wěn)定期．單獨培養(yǎng)莫海威芽孢桿菌和枯草芽胞桿菌均需10 h以上發(fā)酵時間進入對數(shù)生長期，24 h后進入生長穩(wěn)定期［ 12，15］．復合破乳菌所需的發(fā)酵時間更短，進入對數(shù)生長期的時間比培養(yǎng)單菌株的時間提前6 h以上，降低了生產(chǎn)成本．

培養(yǎng)時間在12～24 h時，該生物復合型破乳劑均具有最高的破乳活性．室溫下，接觸時間48 h時，復合生物破乳劑的排油率為100%．組成復合破乳劑的兩株破乳菌主要利用代謝產(chǎn)物破乳，推斷復合后仍為代謝產(chǎn)物的作用，其濃度及性質(zhì)決定破乳效果的高低．對數(shù)生長期及穩(wěn)定期初期，細菌的生長速度快，處于代謝最高峰，培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物的濃度最高，因而生物復合破乳劑破乳活性最高．

莫海威芽孢桿菌全培養(yǎng)液在發(fā)酵時間為20～28 h時排油率為70% ～80%;枯草芽胞桿菌全培養(yǎng)液在發(fā)酵時間為20～26 h時達到最大破乳活性，排油率最高為65%．上述兩種菌株單獨培養(yǎng)的全培養(yǎng)液，具有破乳高活性的時間范圍較窄，破乳效果也有較大的波動，在生產(chǎn)過程中難以控制最佳生產(chǎn)條件．生物復合型破乳劑在12 h的時間范圍均可維持較高的破乳活性．因此，將生物破乳菌復配，可以縮短生產(chǎn)時間，提高產(chǎn)量及破乳效率．

2.2 破乳劑投加量對破乳效果的影響

將不同體積的破乳劑投加至5 mL模型乳狀液中，測試破乳劑的排油率．生物復合型生物破乳劑在用量為2.5 mL時達到破乳最佳效果，排油率100%(如圖2)．莫海威芽胞桿菌培養(yǎng)液的加入量為4 mL可以達到最佳排油效果，48 h排油率63%．枯草芽胞桿菌培養(yǎng)液的最佳加入量則更高，加入6 mL全培養(yǎng)液時，排油率65%．破乳劑投加量在一定范圍內(nèi)，破乳效率隨投加量的增加而增大．達到一定值后，破乳效率基本不變，甚至降低．表明破乳劑用量存在最佳值．破乳劑吸附于乳狀液界面膜上或排替部分表面活性劑，從而破壞界面膜，使其穩(wěn)定性降低，發(fā)生絮凝、聚結(jié)破乳．復合破乳劑中活性物質(zhì)為兩株菌代謝產(chǎn)物總量，較少的加入量便可達到吸附飽和狀態(tài)，達到最佳破乳效果．

圖2 破乳劑投加量對破乳效果的影響

2.3 乳狀液pH對破乳效果的影響

考察了O/W型模型乳狀液pH值為2～10范圍內(nèi)破乳劑的破乳效果(如圖3)．乳狀液pH在3～7范圍內(nèi)，3種生物破乳劑均可達到較高破乳活性．其中，生物復合型破乳劑的破乳效果最好．乳狀液pH為6時，該破乳劑排油率為100%．pH為4時，莫海威芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌破乳活性最高．乳狀液pH在堿性范圍內(nèi)時，破乳劑破乳效果明顯降低．與利用菌體細胞進行破乳的情況不同［16］，復合型生物破乳劑更適于在中性及酸性環(huán)境內(nèi)破乳．

圖3 乳狀液pH對破乳效果的影響

2.4 乳狀液溫度對破乳效果的影響

復合型生物破乳劑與莫海威芽胞桿菌種子液的破乳能力隨乳狀液溫度的變化并不明顯．乳狀液溫度在20～120℃，破乳劑的排油率變化在15%范圍內(nèi)波動．枯草芽胞桿菌種子液受溫度影響較大(如圖4)．將兩種具有破乳效果的菌種復合，可以提高生物破乳劑的穩(wěn)定性，并提高破乳活性．復合型生物破乳劑對乳狀液溫度適用范圍較寬，更適用于對高寒地區(qū)油田原油采出液進行破乳，可以節(jié)省加熱所需的能源消耗從而進一步降低生產(chǎn)成本．

圖4 乳狀液溫度對破乳效果的影響

2.5 生物復合型破乳劑破乳活性分布

全培養(yǎng)液5 000 r/min離心30 min得到上清液．剩余沉淀用蒸餾水清洗兩次再用蒸餾水稀釋至初始體積得到菌懸液．以全培養(yǎng)液的排油率(設(shè)為100%)為對照，考察上清液、菌懸液、培養(yǎng)基48 h排油率．上清液的破乳活性最高，排油率為全培養(yǎng)液的87%．菌懸液48 h排油率為5%，培養(yǎng)基不具破乳活性．由此可知，生物復合型破乳劑破乳有效成分主要存在于去菌細胞上清液中，利用發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物破乳，與推斷的結(jié)果一致．菌懸液的破乳活性可能是菌體細胞表面殘留的細胞代謝產(chǎn)物的作用．

2.6 生物復合型破乳劑對大慶含油廢水的破乳

將3種生物破乳劑用于大慶油田含油廢水(含油廢水含油量為153.217 mg/L)的處理．使用生物復合型破乳劑排油效果最好，排油量為98.909 mg/L，比單菌株培養(yǎng)液的破乳效果提高13%以上．與目前廣泛使用的化學破乳劑(化學－1成分為聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚，化學－2成分為聚乙撐基聚季銨鹽)相比，破乳效果基本接近破乳效果最好的化學 －2(排油量102.715 g/L)，又不會有沉淀生成．破乳后出現(xiàn)清晰油層，更有利于將油水分離．

3 結(jié)論

1)將兩種破乳優(yōu)勢菌混合培養(yǎng)后，發(fā)酵時間縮短為12～24 h，生物復合破乳菌持續(xù)保持最高破乳效果，實現(xiàn)乳狀液完全破乳．

2)復合后，破乳劑最小投加量低于使用莫海威芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌全培養(yǎng)液，破乳活性最高．

3)乳狀液pH在中性及酸性范圍內(nèi)，破乳劑具有最好破乳效果并具有良好耐溫性．

4)破乳活性物質(zhì)存在于去菌上清液中，菌體本身不具有破乳能力，破乳劑主要利用發(fā)酵過程產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物破乳．

5)使用生物復合破乳劑處理大慶含油廢水，排油能力接近使用效果最好的化學破乳劑．

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De-emulsification ability of a microbial compound de-emulsifier

XU Yang1，2，MA Fang1，2，DAI Yang1，2，LI Xu1，2，LIU Chang1，2

(1．State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China，mafang@hit．edu．cn;2．School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China)

The use of microbial de-emulsifier is limited for its low de-emulsification activity，instability and sensitivity to environmental factors．To solve this problem，two superior strains(Bacillus mojavensis，Bacillus subtilis)were cultured in a mineral salt medium to obtain a microbial compound de-emulsifier with high capability of de-emulsification．The cell culture could demulsify the O/W model emulsion completely in 48 h at room temperature．Comparing with that of the single strain culture，the fermentation process of the mixed culture was shortened more than 6 h．With less addition volume，the mixed culture showed higher de-emulsification activity and stability．The microbial compound de-emulsifier kept high de-emulsification activity in the emulsion with different pH value ranged from 3－7．Thermostability was detected．When the emulsion temperature varied from 20－120℃，changing rate of the oil drain rate was under 15%．After the strains were mixed cultured，the metabolites produced during the fermentation process still took the main function of de-emulsifiction．The supernatant remained 87%de-emulsification ability of the cell culture while the bacterial cells could hardly break the emulsion．Comparing with the widely used chemical ones，the microbial compound de-emulsifier has almost the same effectiveness in dealing with the oil-bearing waste water from Daqing oilfield．Compounding microbial de-emulsifiers is an effective way to enhance their demulsification abilities．

microbial compound de-emulsifier;cell culture;emulsion;oil drain rate

X703.1

A

0367－6234(2011)08－0061－04

2010－04－22．

黑龍江省重大攻關(guān)項目(GA06C202)．

徐 暘(1977—)，女，博士研究生;

馬 放(1963—)，男，教授，博士生導師．

(編輯 劉 彤)