鴨綠江鯉魚種質(zhì)資源的微衛(wèi)星分析

閆春梅，張雅斌，鄭 偉*，孫效文，常玉梅，毛瑞鑫，劉慧吉，李忠強(qiáng)，肖志國

（1.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，長春 130033；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)所，哈爾濱 150070）

鯉魚（Cyprinus carpio）是我國分布最廣、地方種群和養(yǎng)殖品種最多的一種淡水魚，其養(yǎng)殖歷史悠久，養(yǎng)殖產(chǎn)量在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占相當(dāng)大的比重。近年來，由于酷魚濫捕、環(huán)境污染等不利因素，江河等野生環(huán)境中的鯉魚資源瀕臨枯竭，嚴(yán)重影響野生資源的生物多樣性。隨著國家對野生水生生物資源的重視，采取了增殖放流等措施以恢復(fù)野生環(huán)境中的資源量。由于有些地區(qū)缺乏對野生種質(zhì)資源的保護(hù)意識、管理措施和必要的鑒定技術(shù)手段，通過人工放流以及養(yǎng)殖品種的逃逸，使養(yǎng)殖鯉魚品種（如建鯉）進(jìn)入鴨綠江自然水域，在一定程度上造成野生鯉魚種質(zhì)資源的混雜。

微衛(wèi)星（Microsatellite DNA）通常以1～6個(gè)堿基為核心序列。具有多態(tài)性高、共顯形、檢測重復(fù)性好、易于鑒定等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于魚類遺傳多樣性的研究[1]，如鯉魚[2]、大麻哈魚[3]、烏蘇里白鮭[4]。本研究采用17對微衛(wèi)星分子標(biāo)記，以黑龍江野鯉（HLJL）作為陽性對照、建鯉（JL）作為陰性對照，對2批采自鴨綠江的鯉魚（YL1，YL2）進(jìn)行遺傳多樣性的分析，對其雜合度等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以期通過對鴨綠江野生鯉魚現(xiàn)存群體的種質(zhì)鑒定，了解鴨綠江鯉魚的遺傳結(jié)構(gòu)特征、種群歷史，為其遺傳資源的保護(hù)提供較為準(zhǔn)確的相關(guān)信息和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚鰭條樣本

本試驗(yàn)4個(gè)鯉魚群體樣本分別采自鴨綠江，其中YL1 38尾，采于2009年4月；YL2 28尾，采于2010年4月；鯉的選育品系建鯉30尾，采于2009年4月。黑龍江撫遠(yuǎn)江段野鯉28尾，DNA樣品由黑龍江水產(chǎn)研究所提供；鰭條樣本均保存于70%乙醇溶液。

所有樣本同步試驗(yàn)。

1.1.2 試劑

微衛(wèi)星引物，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；PCR所用試劑購自于長春TaKaRa公司；其他試劑為國產(chǎn)藥品。

1.2 方法

1.2.1 DNA制備

分別對96尾采自鴨綠江的鯉魚鰭條樣本進(jìn)行DNA提取，每20 mg鰭條加入0.6 mL裂解液（0.5%十二烷基肌胺酸鈉，10 mmol·L－1EDTA（pH 8.0），200 μg·mL－1蛋白酶 K），55 ℃溫育 1～2 h，并不時(shí)輕搖至組織塊完全消化，取上清用酚、氯仿、異戊醇混合液（25∶24∶1）抽提 3遍，之后用無水乙醇－20℃過夜沉淀，再用預(yù)冷的70%乙醇洗滌1次，自然干燥后加 50～100 μL 0.1×TE（pH 8.0）溶解DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA提取質(zhì)量，并黑龍江水產(chǎn)研究所提供的28尾鰭條DNA樣本一起4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物

本研究所用的引物均由黑龍江水產(chǎn)研究所提供，微衛(wèi)星引物序列及復(fù)性溫度見表1。

表1 微衛(wèi)星引物序列Table 1 Microsatellite marker sequence

1.2.3 PCR反應(yīng)程序及產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為15 μL，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性20 s，退火20 s（根據(jù)引物設(shè)定），72℃延伸30 s（擴(kuò)25個(gè)循環(huán)）；72℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，120 V電泳2～5 h。取下凝膠，用0.1%硝酸銀染色液染色，顯色后用照相機(jī)記錄電泳結(jié)果，對擴(kuò)增條帶進(jìn)行分析，記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)所獲得的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，應(yīng)用Popgen32軟件，進(jìn)行等位基因頻率；平均觀測雜合度；平均期望雜合度；有效等位基因數(shù)；遺傳相似系數(shù)；群體間遺傳距離等參數(shù)計(jì)算。再利用PIC計(jì)算軟件計(jì)算平均多態(tài)信息含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA制備結(jié)果

對96尾采自鴨綠江的鯉魚鰭條樣本進(jìn)行DNA提取，結(jié)果顯示所提取DNA條帶清晰，質(zhì)量較好。抽取的部分樣本DNA瓊脂糖凝膠電泳見圖1。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均能較好的擴(kuò)增出目的條帶。每個(gè)座位檢測到1～5個(gè)等位基因，均表現(xiàn)為多態(tài)。引物HLJ036和HLJ338在4個(gè)群體的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

圖1 部分DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Part of DNA agarose gel electrophoresis

圖 2 引物HLJ036（a）和HLJ338（b）在4個(gè)群體的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR profile of HLJ036(a)and HLJ338(b)in four populations

2.3 遺傳多樣性分析

依據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，利用Popgen32軟件，計(jì)算得出4個(gè)群體的微衛(wèi)星座位分析檢測值。檢測結(jié)果顯示，平均觀測雜合度為0.5441～0.6563，平均期望雜合度為0.6362～0.6566，有效等位基因數(shù)為2.9182～3.0124，平均多態(tài)信息含量為0.5728～0.5885，群體間相似系數(shù)在0.8747以上，說明這幾個(gè)群體屬于高度多態(tài)，相似性較高。聚類分析顯示，HLJL與YL1遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近。建鯉與其他3個(gè)群體的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（見表2，圖3）。

表2 鯉魚4個(gè)群體的遺傳距離和相似性指數(shù)Table 2 Genetic identity and genetic distance in four populations

圖3 4個(gè)鯉魚群體的UPGMA聚類Fig.3 Dendrogram of the four populations using UPGMA method

3 討 論

微衛(wèi)星研究方法是近幾年來廣為應(yīng)用的遺傳分子標(biāo)記，變異水平較高，且可通過PCR獲得多肽信息[5]，與同工酶等方法相比，更適合親緣關(guān)系較近的種群遺傳關(guān)系分析[6－7]。

本研究的目的是鑒別從鴨綠江捕獲的兩批鯉魚是否為野生品種。對經(jīng)鑒定確系野生品種的鯉魚進(jìn)行人工增殖放流，以增加天然水域的野生品種覆蓋率。由于在養(yǎng)殖品種當(dāng)中，框鏡鯉等養(yǎng)殖種類鯉魚在生物學(xué)性狀上與野生鯉魚具有較大差異，可以在眼觀上進(jìn)行辨別，只有建鯉的體長、體色等生物學(xué)性狀與野生鯉魚類似，與野生鯉魚在外觀上很難區(qū)分，切培育時(shí)間長，目前在整個(gè)鴨綠江流域廣泛養(yǎng)殖，數(shù)量巨大，很容易與野生鯉魚混淆，因此，選擇了建鯉作為養(yǎng)殖品種的代表進(jìn)行對比鑒定。

為篩選鴨綠江流域自然環(huán)境中野生鯉魚親本，根據(jù)鴨綠江流域的可能存在的鯉魚品系設(shè)計(jì)本試驗(yàn)。首先考慮到流域內(nèi)網(wǎng)箱養(yǎng)殖可能逃逸的養(yǎng)殖品種，多年來該流域養(yǎng)殖品種為建鯉，設(shè)為陰性對照。以已知的野生的、生存環(huán)境相似的鯉魚－黑龍江野鯉作為陽性對照，先后對66尾捕自鴨綠江流域的鯉魚親魚進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，所采捕的兩批鴨綠江鯉魚與建鯉處在不同的分支上，與黑龍江野鯉處于同一進(jìn)化分支上，從表2可見，YL1與的遺傳相似指數(shù)最高，達(dá)到0.9489，YL2與HLJL的遺傳相似指數(shù)也達(dá)到0.9180，顯著高于與JL的遺傳相似指數(shù)，因此可以說，兩批鴨綠江鯉魚與黑龍江野鯉親緣關(guān)系很近，因此，認(rèn)為所采捕的兩批鴨綠江鯉魚均為野生品種，可以用與增殖放流。

微衛(wèi)星方法是檢測共顯性遺傳特征的分辨率很高的較新遺傳學(xué)研究方法，目前已成為種群遺傳結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析的有效分子標(biāo)記[8－9]。本研究試驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究中的4個(gè)鯉魚群體平均觀測雜合度均在0.5以上，平均期望雜合度高于0.6。平均雜合度是被檢測位點(diǎn)上群體的雜合子頻率，用于檢測群體內(nèi)遺傳變異，是群體雜合程度的度量單位[10－11]。本研究中4個(gè)群體的平均雜合度均高于0.5，表明各群體的遺傳多樣性均較高，尤其是YLI，YL2和HLJL三個(gè)群體，具有較豐富的育種和遺傳改良潛力，應(yīng)采取相應(yīng)措施予以保護(hù)。

除了雜合度以外，微衛(wèi)星還可以通過平均多肽信息含量（PIC）來檢測位點(diǎn)多態(tài)性。當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，為高度多態(tài)位點(diǎn)；0.25＜PIC＜0.5時(shí)為中度多態(tài)位點(diǎn)；PIC＜0.25時(shí)為低度多態(tài)位點(diǎn)[12－13]，本研究中4個(gè)群體的平均多態(tài)信息含量為0.5728～0.5885，證明本試驗(yàn)中所選微衛(wèi)星位點(diǎn)都具有高多態(tài)性?？梢杂行У赜糜谌后w遺傳結(jié)構(gòu)分析。

微衛(wèi)星方法采用Fis值來衡量群體內(nèi)雜合程度。對本研究的4個(gè)群體的分析表明，4個(gè)群體均表現(xiàn)為一定程度的雜合度缺失，造成這一結(jié)果的原因可能是試驗(yàn)中所測樣本的含量較少，因?yàn)樵囼?yàn)中所測樣本含量過少，無效等位基因的存在等原因都可能導(dǎo)致雜合度計(jì)算值偏低[14－15]。

本研究的目的是鑒定4個(gè)鯉魚群體的遺傳關(guān)系，確定所采捕的兩批鴨綠江鯉魚是否為野生品種，因此，遺傳距離和遺傳相似度是重要的待衡量指標(biāo)。在群體的進(jìn)化研究中，可通過計(jì)算遺傳距離來鑒定種間遺傳結(jié)構(gòu)及分化關(guān)系。微衛(wèi)星研究方法認(rèn)為遺傳距離越遠(yuǎn)，分化時(shí)間越長，雜種優(yōu)勢越大，即遺傳距離與分化關(guān)系呈正相關(guān)。群體間遺傳距離只有高于0.05，才可認(rèn)為群體間發(fā)生了分化，否則認(rèn)為群體間為分化，可進(jìn)行群間合并[16-17]。因此，為了保存種間遺傳變異，必須采用切試可行的方法來測定種間遺傳分化。微衛(wèi)星方法就是較好的可選方法，不僅可以較準(zhǔn)確的預(yù)測雜種優(yōu)勢及其優(yōu)劣性，還可以避免盲目的展開雜交試驗(yàn)[18]，為現(xiàn)代遺傳育種學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過本試驗(yàn)確定YL1和YL2群體與養(yǎng)殖品系建鯉不處在同一進(jìn)化分支上，遺傳距離較遠(yuǎn)。與黑龍江野鯉群體的遺傳相似性較高，遺傳距離較近，其中YL1與HLJL親緣關(guān)系最近。表明所鑒定的兩批采自鴨綠江的鯉魚均系野生品種，可以用來作為人工繁育的親本，其培育出的子一代苗種可以用于放流以增加鴨綠江天然水域的野生鯉魚良種資源，保護(hù)自然環(huán)境中土著優(yōu)良品種的質(zhì)量安全。

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