傳染性造血組織壞死病毒糖蛋白基因的原核表達及抗原性分析

趙永欣，趙麗麗，劉巍巍，王健楠，李一經，喬薪瑗，葛俊偉，劉 敏*

（1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030）

傳染性造血組織壞死?。↖nfectious hematopoietic necrosis，IHN）是鮭、鱒魚類一種嚴重的傳染性疾病。隨著水生動物及其產品進出口貿易，世界范圍內的傳染性造血組織壞死病急劇增加，已有報道在日本、韓國、中國、歐洲等地區(qū)檢測到該病病毒[1－2]。本實驗室從黑龍江省某漁場病魚組織內分離得到傳染性造血組織壞死病毒IHNV－ZYX株（GenBank編號HM099906），病魚的癥狀為體色發(fā)黑，眼球突出，腹部膨大，鰭基充血，腹鰭基部的骨胳肌中有“V”形出血斑塊，經解剖可觀察到，魚的鰓絲褪色呈蒼白色，肝、脾、腎褪色。

傳染性造血組織壞死病病毒為傳染性造血組織壞死病的病原體，屬彈狀病毒科（Rhabdoviridae）諾拉彈狀病毒屬（Novirhabdovirus），呈子彈狀，基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA[3－4]。此病毒具有囊膜，其囊膜蛋白（G）是糖基化蛋白，N端具有一段疏水性的信號肽，在內質網中被切除后成為成熟的糖蛋白，糖基化是病毒顆粒在成熟過程中由宿主細胞內分泌到細胞外所必需的[5]。G蛋白在膜融合及決定病毒毒力方面起著重要作用，還是病毒的主要抗原，可以誘導產生中和抗體[6]，刺激細胞免疫[7]。

本試驗將IHNV－ZYX株全長的G基因（1 527 bp）進行了原核表達，制備了抗G蛋白血清，分析了IHNV G蛋白的抗原性，為進一步研究IHNV G基因的免疫保護作用及診斷試劑和基因工程疫苗的研制奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

毒株、菌株與質粒：IHNV－ZYX株為本實驗室分離，CHSE－214細胞由深圳出入境檢驗檢疫局江育林教授惠贈，Rosetta（DE3）菌株、pET－30b載體由本實驗室保存。

主要試劑：限制性內切酶（購自TaKaRa公司）；T4DNA連接酶（購自NEB公司）；HRP標記的山羊抗兔IgG、兔抗山羊IgG（購自Sigma公司）；山羊抗IHNV陽性血清由深圳檢疫局劉葒饋贈。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據GenBank登錄的IHNV基因序列（L40883），設計兩對引物：G基因（1 527 bp）上游引物：Gu 5′GGATCCGATGGACACCATGATCACCAC 3′含有BamHⅠ酶切位點,下游引物：Gl 5′CTCGAGGGAC CGGTTTGCCAGGTGATA 3′含XhoⅠ酶切位點。由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 重組表達質粒pET30b－G的構建

將用CHSE－214細胞繁殖的IHNV－ZYX株病毒，經Trizol裂解后，以氯仿、異丙醇抽提病毒總RNA，RT－PCR方法分別擴增得到G基因片段。將G基因PCR產物分別與pMD18－T連接，轉化JM109感受態(tài)細胞，提取質粒，經酶切鑒定篩選陽性克隆、測序。獲得陽性重組質粒后用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，純化后連接到經同樣雙酶切純化的pET－30b載體，構建重組表達質粒pET30b－G。

1.2.3 重組蛋白的誘導表達及鑒定

將 pET30b－G轉化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達0.6時，經IPTG誘導進行表達。表達產物進行SDS－PAGE分析。

1.2.4 抗體的制備

將 pET30b－G/Rosetta（DE3）重組菌誘導后提取包涵體，經SDS－PAGE分離目的片段，將凝膠在0.25 mol·L－1KCl溶液中染色，切下目的膠條并碾碎，加入少量的PBS后反復凍融3次，離心取上清并測得G蛋白濃度為3.95 mg·mL－1。以處理后的G蛋白加弗氏佐劑，按參考文獻[8]介紹的方法分3次免疫新西蘭兔，三免后第7天心臟采血，分離血清，－80℃保存。

1.2.5 抗體效價的檢測及抗原性分析

用重組G蛋白包被ELISA板，兔抗G蛋白血清和兔陰性血清為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG作為二抗，OPD顯色。結果判定:當P/N=（陽性血清OD490的值－空白孔OD490的值）/（陰性血清OD490的值－空白孔OD490的值）＞2時，陽性血清的最大稀釋度即為血清抗體效價。同時用感染IHNV的細胞培養(yǎng)物包被ELISA板，用同樣的方法測定G蛋白抗血清與病毒的反應性。

將誘導后的G蛋白進行SDS－PAGE電泳并轉膜，以山羊抗IHNV陽性血清為一抗，HRP標記的兔抗山羊IgG為二抗，進行Western－blot分析。

2 結果與分析

2.1 目的基因擴增及重組表達質粒pET30b-G的構建

以IHNV－ZYX株cDNA為模板，通過PCR擴增，獲得擴增片段G基因約為1 527 bp，與預期大小相符。測序結果表明通過RT－PCR方法成功地擴增了G目的基因。用Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切pET30b－G質粒，分別得到約5 400和1 527 bp的片段，酶切鑒定與預期相符（見圖1）。

圖1 重組質粒pET30b-G酶切PCR鑒定結果Fig.1 Restriction map of pET30b-G

2.2 重組蛋白的誘導表達

結果見圖 2。重組菌 pET30b－G/Rosetta（DE3）誘導后在約52 ku處出現蛋白條帶，與預期重組蛋白分子質量一致。且一定范圍內隨著誘導時間的延長，表達量逐漸增多，在誘導4 h時表達量最大。超聲波處理誘導后菌體，經SDS－PAGE分析，菌體在沉淀中有目的蛋白，可知此蛋白以包涵體形式存在。

圖2 重組菌pET30b-G/Rosetta(DE3)表達蛋白SDSPAGE鑒定結果Fig.2 SDS-PAGE profile of pET30b-G/Rosetta(DE3)expressed protein

2.3 抗血清效價的測定

將本試驗制備的兔抗G蛋白血清作為陽性血清，免疫接種前兔血清作為陰性血清，重組G作為抗原，進行間接ELISA試驗。結果表明抗血清與相應的抗原有較強的反應性，滿足P/N＞2時，血清的最大稀釋度分別為1∶25 600，即為制備的兔抗G蛋白血清效價（見表1）。

表1 間接ELISA檢測G蛋白結果Table 1 Indirect ELISA result of inspection

2.4 G蛋白免疫原性的檢測

用感染IHNV－ZYX株的細胞培養(yǎng)物包被ELISA板，與兔抗G蛋白的免疫血清進行試驗，結果見圖3。

從結果可知，抗G蛋白的兔血清稀釋度為1∶1 600時，P/N仍大于2。說明制備的抗血清與全病毒抗原發(fā)生較強的特異性反應，抗G蛋白的免疫血清能夠識別IHNV抗原，G蛋白具有良好的免疫原性。

重組G蛋白經SDS－PAGE轉印到NC膜上，山羊抗IHNV血清1∶1 000稀釋作為一抗，HRP兔抗山羊IgG1∶2 000稀釋作為二抗，Western－blotting結果見圖4。誘導后的G菌體蛋白在52 ku處出現了明顯的特異性條帶，而未經誘導的菌體蛋白無條帶產生。Western－blotting結果表明，重組G蛋白可被山羊抗IHNV血清識別，G蛋白具有良好的反應原性。以上兩項結果說明，表達的G蛋白與天然的IHNV G蛋一樣具有相同的抗原性。

圖3 間接ELISA檢測抗G蛋白兔血清效價結果Fig.3 Result of G protein infected rabbit

圖4 表達目的蛋白的Western-blotting檢測Fig.4 Identification of expressed protein by Westernblotting

3 討論與結論

G蛋白是傳染性造血組織壞死病毒的主要抗原，可誘導動物機體產生特異性的免疫應答，還可以作為研究IHNV免疫保護的抗原基因，因此通常選擇G基因作為抗原基因來構建DNA疫苗[7]。有報道指出肌肉注射G蛋白表達質?？烧T導機體產生高水平免疫率[9-11]。Lorezen等構建了IHNV病毒G蛋白基因的DNA疫苗[12-13]，能夠誘導虹鱒產生75%的較高水平的免疫保護率。Kim等認為該病毒G蛋白一個氨基酸的改變會影響病毒的毒力和致病性[14]。因此，G蛋白在傳染性造血組織壞死病毒基因工程疫苗和診斷技術等方面的研究中是重要的靶蛋白。目前國內對此研究較少，2009年郭露玲等對其進行了原核表達但并未分析該蛋白的功能特性[15]，本研究的病毒株IHNV-ZYX為本實驗室獲得的分離株，更深一步地對其功能進行研究是很有必要的。

本試驗獲得分離株IHNV-ZYX G基因全長cDNA序列，而且成功構建了表達IHNV G蛋白大腸桿菌載體系統(tǒng)，可以在IPTG的誘導下大量表達G蛋白，純化后制備了高效價的抗血清，兔抗G蛋白的血清可與IHNV特異反應，表明G蛋白具有良好的免疫原性。同時，本試驗制備的G蛋白可被山羊抗IHNV陽性血清識別，反應條帶單一，說明表達的G蛋白也具有良好的反應原性。本試驗的結果表明，以原核表達系統(tǒng)表達的G蛋白可以作為檢測抗原，完全可以代替全病毒制備抗原進行病毒繁殖，病毒純化等繁瑣工藝，這對于IHNV在細胞上繁殖周期長，繁殖IHNV的細胞培養(yǎng)難度大具有更重要的現實意義。因此，G蛋白可作為IHNV的診斷抗原，為建立診斷檢測方法，流行病學調查等研究奠定了基礎。

分離株IHNV-ZYX G基因全長cDNA序列的獲得為研究分離株的免疫學特性及對其編碼的G基因結構與功能的深入研究奠定基礎，分離株G蛋白具有良好的免疫原性也為IHNV的免疫預防提供重要的理論基礎。

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