肌肉萎縮蛋白Fbox-1基因沉默對(duì)糖皮質(zhì)激素作用下肌管萎縮的影響

王會(huì)玲 許 燁 張金元

終末期腎功能衰竭(ESRF)和透析患者常并發(fā)進(jìn)行性蛋白質(zhì)-能量消耗(protein-energy wasting，PEW)，其中骨骼肌消耗(muscle wasting)是導(dǎo)致腎功能衰竭患者虛弱、乏力、生活質(zhì)量下降的主要原因，也是患者蛋白質(zhì)-能量性營養(yǎng)不良的主要機(jī)制[1]。影響肌肉蛋白質(zhì)代謝的機(jī)制尚不清楚，尿毒癥時(shí)毒素蓄積、代謝性酸中毒、胰島素抵抗、微炎癥狀態(tài)等，都可能促進(jìn)/加速骨骼肌蛋白質(zhì)分解代謝[2]。文獻(xiàn)報(bào)道泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system，UPS)是蛋白質(zhì)分解的重要執(zhí)行者，代謝狀態(tài)下內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GC)水平升高，可競(jìng)爭性拮抗胰島素受體信號(hào)，刺激肌萎縮關(guān)鍵基因表達(dá)[3]。我們既往研究顯示小鼠慢性腎臟病(CKD)模型的血清GC水平可顯著升高10～13倍[4]。本研究通過體外培養(yǎng)肌細(xì)胞，研究GC對(duì)肌管蛋白質(zhì)代謝影響及肌肉萎縮蛋白Fbox-1(muscle atrophy F-box,MAFbx,也稱為Atrogin-1)的作用機(jī)制。

材料和方法

材料與試劑小鼠肌纖維細(xì)胞株 C2C12細(xì)胞(ATCC A)(晶天生物科技公司)；綠色熒光蛋白病毒載體(SMARTvector Empty vector，Dharmacon)；DMEM培養(yǎng)液(Cellgrov)；胎牛血清(GIBCO)，馬血清(Sigma)；液閃計(jì)數(shù)器(Beckman)；CellLyticTMMT細(xì)胞裂解液(Sigma)；RNA提取試劑TRIzol Reagent(invitrogen)；siRNA-Atrogin-1試劑盒(Dharmacon，ON-Target plus SMARTpool，mouse FBx032，Cat#L-049180-00)；Fbx一抗(Everest)；地塞米松(dexmethasone，DEX；American Regent Lab Inc)；熒光倒置顯微鏡(Olympus 1x70)。

C2C12體外培養(yǎng)及肌管形態(tài)觀察C2C12細(xì)胞以1×106cell/cm2密度接種于6孔板，用含10%胎牛血清的DMEM，置37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)90%密度時(shí)，換含2%的馬血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，3～4d后細(xì)胞融合分化形成肌管，加入GFP 2 μl/孔，24h后熒光倒置顯微鏡觀察肌管已著色，用DEX處理細(xì)胞，48h后觀察肌管形態(tài)并拍照，用ImageJ軟件(NIH，F(xiàn)rederick，MD)分析。

3H-酪氨酸同位素標(biāo)記檢測(cè)肌管蛋白合成和分解蛋白合成采用3H-酪氨酸(3H-Tyrosine)摻入法檢測(cè)，在細(xì)胞分化形成肌管后第2～3d，每孔加入2.5 μmol/L3H-Tyrosine×30 min，藥物處理2h后，DMEM洗3次×10 min，刮下細(xì)胞，以10%三氯乙酸(TCA)沉淀，用0.5N純堿溶解沉淀，進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)并測(cè)定蛋白濃度，結(jié)果以cpm/g表示。蛋白分解采用3H-Tyrosine釋放率檢測(cè)，肌管分化好后，加入3H-Tyrosine×20h，用含2%馬血清的DMEM洗3遍以除去培養(yǎng)液中的3H-Tyrosine，加入含2 mmol/L Tyrosine的DMEM，2h后加入藥物處理細(xì)胞，提取300 μl培養(yǎng)液加入TCA 33.3 μl使終濃度為10%，以后每4h取300 μl培養(yǎng)液并加入TCA，最后一次取樣后將細(xì)胞刮下移入Ep管，離心，沉淀用0.5N純堿溶解，所有樣本取200 μl進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)。蛋白降解率計(jì)算：各時(shí)間點(diǎn)cpm值/cpm總和×100%，繪制曲線。

Western blot分析Atrogin-1表達(dá)水平CellLyticTMMT細(xì)胞裂解液提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)蛋白濃度，10 % SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，加入抗-Atrogin-1(Fbx 一抗)；4℃過夜，加入熒光二抗抗山羊或兔IgG(donkey anti-goat/Rabbit IgG)(Invitrogin，Alexa Fluor 680/800)，Odyssey激光成像系統(tǒng)(LiCor)掃描，蛋白表達(dá)量用內(nèi)參照GAPDH校正。

Nothern Blot分析Atrogin-1基因沉默采用小分子干擾DNA片段(siRNA)核糖核酸干擾技術(shù)，觀察DEX作用下C2C12肌管形態(tài)及Atrogin-1表達(dá)。方法如下：Mafbx-32 siRNA 6 μl 用100 μl siRNA Transfection Media(Invitrogen)稀釋，轉(zhuǎn)染肌管24h后，加入DEX 5 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用TRIzol Reagent(invitrogen)提取總RNA，Northern blot檢測(cè)肌管中Atrogin-1mRNA表達(dá)水平。RT-PCR擴(kuò)增引物制備探針，引物序列Atrogin-1：(forward)5′-GCA AAC ACT GCC ACA TTC TCTC-3′；(reverse)5′-CTT GAG GGG AAA GTG AGA CG-3′；GAPDH(glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase)探針購自Ambion。采用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Amersham)、α-32P dCTP-標(biāo)記cDNA 探針，膜置于42℃雜交16h，分別以2×、0.2×SSC/0.1%SDS、去離子水洗膜。薄膜置于暗盒中，壓上X光片，置-70℃放射自顯影24h。mRNA相對(duì)表達(dá)量用GAPDH校正。

結(jié) 果

地塞米松可引起體外培養(yǎng)肌管萎縮體外培養(yǎng)肌細(xì)胞融合形成肌管后，加入綠色熒光蛋白可使肌纖維著色，紫外線下呈綠色，肌管粗壯呈條索狀，內(nèi)見融合的細(xì)胞核呈點(diǎn)狀強(qiáng)烈熒光，GFP不引起肌纖維性狀改變。DEX 0.5 μmol/L作用24h后肌管形態(tài)無明顯改變，1 μmol/L已引起肌管變細(xì)，5 μmol/L則肌纖維明顯變細(xì)，排列稀疏。DEX 5 μmol/L作用24h后，測(cè)量肌纖維直徑較正常對(duì)照組明顯下降[(9.69±2.86)μm DEXvs(18.3±3.57)μm GFP，P<0.01)]，提示DEX可引起體外培養(yǎng)肌管萎縮，隨DEX劑量增加，肌管逐漸變細(xì)(圖1 A、B)。

圖1 A：培養(yǎng)的C2C12肌細(xì)胞經(jīng)分化后形成肌管，熒光顯微鏡觀察肌管呈條索狀，GFP使其著色呈綠色熒光，內(nèi)見融合的細(xì)胞核呈點(diǎn)狀強(qiáng)烈熒光；地塞米松(DEX 0～5 μmol/L)作用24h后，DEX > 1 μmol/L可引起肌管萎縮，形態(tài)表現(xiàn)為肌纖維變細(xì)，排列稀疏(×400)； B：DEX(0～5 μmol/L)作用24h后，測(cè)量肌管直徑逐漸變細(xì)； C：DEX 5 μmol/L作用(0～24h)可促進(jìn)蛋白分解增加，24h時(shí)3H-Tyrosine釋放率較對(duì)照組升高24.7%； D：DEX 5 μmol/L作用24h后蛋白質(zhì)合成(3H-Tyrosine摻入率)較對(duì)照組下降17.4%； E：Western blot顯示DEX劑量依賴性地引起Atrogin-1蛋白表達(dá)水平升高

地塞米松促使肌管分解代謝和Atroign-1表達(dá)升高給予DEX 5 μmol/L作用0～24h，各時(shí)間點(diǎn)3H-Tyrosine釋放率逐漸增加，16h后與對(duì)照值(CTL)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)；24h時(shí)3H-Tyrosine釋放率升高24.7%；同時(shí)間點(diǎn)肌管3H-Tyrosine摻入水平較CTL明顯降低[(39.22±6.22)cpm/g DEXvs(47.53±4.32)cpm/g CTL；P=0.047)，摻入率下降17.4%。提示DEX可引起蛋白質(zhì)合成代謝輕度下降，顯著促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)分解(圖1 C、D)。DEX 0～5 μmol/L作用24h，檢測(cè)Atrogin-1蛋白表達(dá)水平升高，以DEX 5 μmol/L作用最顯著(圖1E)。

表1 地塞米松5 μmol/L作用后各時(shí)間點(diǎn)肌管3H-Tyrosine釋放率(%)

Atrogin-1基因沉默可改善DEX引起的肌管萎縮應(yīng)用siRNA技術(shù)使Atrogin-1基因沉默，肌管再經(jīng)DEX 5 μmol/L處理24h后，Northern blot結(jié)果提示siRNA可使Atrogin-1 mRNA表達(dá)水平顯著下降；siRNA對(duì)照組Atrogin-1 mRNA表達(dá)水平升高約3倍，siRNA-Atrogin-1組僅升高約10%；同時(shí)Western blot 結(jié)果提示Atrogin-1蛋白表達(dá)也顯著下降(圖2A)。Atrogin-1基因沉默后，再經(jīng) DEX 5 μmol/L處理24h，鏡下觀察肌管形態(tài)未見明顯改變，SiRNA-Atrogin-1組的肌管直徑為[(15.81±3.37)μm DEX)vs(18.63±3.48)μm CTL]，而siRNA-CTL組則出現(xiàn)明顯肌管萎縮[(8.64±2.41)μm DEXvs(17.36±3.85)μm CTL，P<0.01)]。上述結(jié)果提示Atrogin-1基因沉默對(duì)DEX引起的肌萎縮具有保護(hù)作用。

圖2 A：Northern blot 顯示DEX 5 μmol/L作用24h后，siRNA-對(duì)照組的Atrogin-1 mRNA水平升高約3倍，siRNA-Atrogin-1組的Atrogin-1 mRNA 水平較對(duì)照組僅升高約10%； Western blot顯示靶基因沉默后Atrogin-1蛋白表達(dá)水平明顯下降；B：光鏡下觀察肌管形態(tài)變化，Atrogin-1基因沉默，再次給予DEX 5 μmol/L作用24h后，未見肌管明顯萎縮(×200)

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)病理?xiàng)l件下內(nèi)源性GC水平升高可能是促進(jìn)蛋白質(zhì)分解的重要因素[5]。May等[6]以NH4Cl造成的代謝性酸中毒大鼠為模型，發(fā)現(xiàn)24h尿液中皮質(zhì)酮水平升高12倍以上；我們既往研究提示尿毒癥小鼠模型其內(nèi)源性GC水平較正常對(duì)照組升高13倍以上。本研究采用體外培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞，并使之分化為具有肌肉特性的肌管，給予外源性DEX后可以顯著刺激肌管萎縮，并影響蛋白質(zhì)代謝，使肌肉蛋白質(zhì)合成下降，明顯促進(jìn)蛋白質(zhì)分解代謝。這表明高水平的GC可降低肌肉蛋白合成，加速蛋白分解。

體內(nèi)蛋白質(zhì)分解主要通過3種途徑，溶酶體-蛋白酶途徑、鈣依賴-蛋白酶途徑和ATP-泛素-蛋白酶途徑，目前確定后者是體內(nèi)蛋白分解的主要途徑。病理狀態(tài)下肌肉特異性的E3連接酶——Atrogin-1被激活，并通過蛋白酶體直接將骨骼肌蛋白質(zhì)分解為多肽或氨基酸片段，編碼Atrogin-1的基因可能是控制肌肉蛋白分解的關(guān)鍵基因[7]。Mitch等[8]發(fā)現(xiàn)切除動(dòng)物腎上腺或給予GC受體阻滯劑后，可以抑制酸中毒、胰島素缺乏、饑餓或膿毒血癥狀態(tài)下的肌肉萎縮，若再次給予高于生理劑量的GC后，又可出現(xiàn)UPS激活并引起肌肉萎縮。本研究明確DEX可以劑量依賴性地刺激Atrogin-1蛋白表達(dá)，提示GC可直接升高Atrogin-1而引起肌肉萎縮。我們最近對(duì)GC引起肌萎縮的機(jī)制的研究，揭示GC通過其受體(glucocorticoid receptor，GR)直接干預(yù)胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)相關(guān)的 PI3K/Akt活性，促進(jìn)Atrogin-1 mRNA表達(dá)，使PI3K/Akt活性下降，引起肌肉萎縮；肌肉特異性GR敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠(muscle glucocorticoid receptor knock-out，MGRKO)，可抵抗糖尿病引起的Atrogin-1 mRNA表達(dá)；我們還發(fā)現(xiàn)生理劑量的GC可加劇胰島素受體敲除小鼠的肌肉蛋白分解，GR激活后可競(jìng)爭PI3K，這一非基因性的競(jìng)爭作用損害胰島素信號(hào)，使蛋白分解增加。

目前對(duì)骨骼肌消耗性營養(yǎng)不良尚無有效治療方法，以基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行干預(yù)是目前最前沿的研究方向。Atrogin-1基因是否專一性地控制骨骼肌萎縮？我們采用RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)予以明確。RNAi是一種高效的基因表達(dá)阻斷技術(shù)，它通過體外合成或體內(nèi)表達(dá)含21～23個(gè)核苷酸的雙鏈siRNA，對(duì)特定基因進(jìn)行功能封閉或降低表達(dá)，以確定靶基因的功能，siRNA 技術(shù)也稱基因沉默技術(shù)(gene silence)。由于 siRNA 具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失，它比反義 RNA 技術(shù)和同源共抑制法更有效，因此 siRNA 可以作為一種強(qiáng)有力的研究工具[10]。我們對(duì)Atrogin-1基因沉默后，再次給予DEX則不引起的肌管萎縮，提示以Atrogin-1基因?yàn)橹委煱悬c(diǎn)，抑制Atrogin-1的表達(dá)，對(duì)GC作用下的肌萎縮具有保護(hù)作用。

綜上所述，本研究明確GC通過激活A(yù)trogin-1，引起肌肉細(xì)胞蛋白質(zhì)分解代謝增加，并抑制蛋白合成代謝，從而導(dǎo)致肌肉萎縮；Atrogin-1基因沉默可改善GC引起的肌肉萎縮，Atrogin-1基因可能是逆轉(zhuǎn)肌肉消耗性營養(yǎng)不良的有效靶點(diǎn)。

特別感謝美國Baylor醫(yī)學(xué)院腎臟病實(shí)驗(yàn)室胡兆勇博士的指導(dǎo)和幫助！

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4 王會(huì)玲,桂志紅,許 燁,等.CKD時(shí)高糖皮質(zhì)激素通過激活 Atrogin-1、MuRF-1引起骨骼肌萎縮.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2010,11:951-956.

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