杜仲內(nèi)生真菌的分離鑒定及其對異甜菊醇的生物轉(zhuǎn)化研究

陳峻青，王伊文，馮成亮，蔡進(jìn)，吉民

(1.東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，江蘇南京 211189;2.解放軍302醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100039)

異甜菊醇屬四環(huán)二萜類化合物，為來源于植物甜菊的天然甜味劑甜菊苷的酸水解產(chǎn)物。藥理研究表明，異甜菊醇可抑制DNA聚合酶 polα活性，預(yù)防腫瘤細(xì)胞生長［1-2］;可降低心肌細(xì)胞ATP水平，發(fā)揮抗心肌缺血作用［3-4］;可降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，使血管舒張，降低血壓［5-6］;可抑制單糖轉(zhuǎn)運，減少葡萄糖生成［7-10］。由于其廣泛的藥理活性和極好的研究價值，對異甜菊醇的結(jié)構(gòu)修飾和活性研究受到了較多的關(guān)注。生物轉(zhuǎn)化是利用生物體系 包括真菌 細(xì)菌 植物離體培養(yǎng)細(xì)胞、組織或器官和動物細(xì)胞等)或其產(chǎn)生的酶制劑對外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的生物化學(xué)過程。異甜菊醇的二萜骨架是研究生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的合適底物，利用合適的菌種，可在異甜菊醇碳架的非活性部位進(jìn)行多種類型的區(qū)域選擇性和立體選擇性反應(yīng)［11-12］，但已發(fā)現(xiàn)的能夠?qū)Ξ愄鹁沾歼M(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的菌株種類較少，且其生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)類型單一。

植物內(nèi)生菌［13］是指那些其全部或部分生活史在健康植物的各種組織或細(xì)胞內(nèi)部度過的菌(包括放線菌)，其存在不引起明顯的宿主感染癥狀，是一個龐大的特殊微生物類群。內(nèi)生菌具備許多顯著又新穎的特性，并能分泌多種胞外酶以維護(hù)自身的生存狀態(tài)，這些特定的酶類在一定條件下可被開發(fā)利用。目前國內(nèi)外研究者們對內(nèi)生菌的研究多集中于內(nèi)生菌群體特征、次生代謝物中活性物質(zhì)的分離提取及次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生機(jī)理等，對植物內(nèi)生菌用于外源性底物生物轉(zhuǎn)化的報道很少。本研究從植物杜仲的根、莖、葉中分離內(nèi)生真菌并進(jìn)行初步鑒定，對獲得的52株內(nèi)生真菌進(jìn)行了異甜菊醇轉(zhuǎn)化活性的篩選研究，以期發(fā)現(xiàn)更多的異甜菊醇生物轉(zhuǎn)化類型和轉(zhuǎn)化菌株，并獲取更多種類的藥理活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器和試劑 主要儀器:DHZ-D冷凍恒溫振蕩器(太倉實驗設(shè)備廠)，SW-CJ-1FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，SHP-300F生化培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)，EX20生物顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)，LDZX-50KB高壓滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，F(xiàn)A1004電子分析天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)。

主要試劑:葡萄糖、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、硫酸、乙醇、氯仿、甲醇、瓊脂(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司)，甜菊苷(95%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，異甜菊醇(自制，并經(jīng) IR，1HNMR，13CNMR，MS及元素分析確證)，馬鈴薯(市售)。

1.1.2 杜仲樣品 杜仲，取自南京老山，無其他病蟲害。取材部位為根、莖和葉。

1.1.3 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基(抗生素培養(yǎng)基):硫酸鏈霉素200 mg，瓊脂20 g，水1 000 ml。菌種純化及保藏均采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，水 1 000 ml。

1.2 內(nèi)生真菌的分離純化

取杜仲多年生根、莖，刮去外表皮后，剝下根皮、枝皮 用無菌水沖洗后剪成 的小塊 置于75% 乙醇消毒 2 min，再用 2.5%次氯酸鈉消毒10 min，最后用75%乙醇消毒1 min，無菌水沖洗3～4次，接入PDA平板培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3～7 d。葉片沖洗后剪為0.5 cm×0.5 cm大小，作與根皮、莖皮相同的處理，接至PDA平板培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)。取切口處新長出的菌絲，及時轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng)，并根據(jù)菌落形態(tài)、顏色差異及長出時間的不同，分別挑取各平板上菌落邊緣的菌絲接于新的平板上進(jìn)行分離培養(yǎng)。采用菌絲頂端純化法逐步純化，對菌株編號后，轉(zhuǎn)至PDA斜面培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，然后放入4℃冰箱保存［14］。

1.3 內(nèi)生真菌的分離鑒定

采用形態(tài)學(xué)法，根據(jù)內(nèi)生真菌主要的群體形態(tài)特點(包括菌落大小、顏色、表面特征、質(zhì)地)和個體形態(tài)特點(包括菌絲子實體和孢子形態(tài))，對其進(jìn)行鑒定和分類［15-16］。

1.4 內(nèi)生真菌的生物轉(zhuǎn)化活性研究

1.4.1 內(nèi)生真菌的培養(yǎng) 將分離獲得的內(nèi)生真菌分別接入PDA固體培養(yǎng)基中，于生化培養(yǎng)箱(28℃)中培養(yǎng)4 d備用。

1.4.2 異甜菊醇的制備及預(yù)處理 于500 ml三頸瓶中加入40 g(0.049 7 mol)甜菊苷，400 ml 10%硫酸，40 ml乙醇，在95℃下機(jī)械攪拌反應(yīng)7 h。待冷，抽濾得黃色固體，乙醇重結(jié)晶，得白色固體12 g，收率76%。取0.1 g自制異甜菊醇溶于10 ml DMSO，紫外燈照射滅菌后，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 生物轉(zhuǎn)化篩選實驗 供篩選的杜仲內(nèi)生真菌分別經(jīng)平面PDA培養(yǎng)4 d后，用打孔器制成直徑5 mm的菌餅，轉(zhuǎn)接到裝有20 ml發(fā)酵液的100 ml三角瓶中，28 ℃、150 r·min－1震蕩培養(yǎng) 2 d 后，加入 0.2 ml底物溶液，使異甜菊醇的終濃度為0.1 mg·ml－1。并設(shè)3個對照:對照1(轉(zhuǎn)化菌株+丙酮+培養(yǎng)基)、對照2(底物+培養(yǎng)基)和對照3(純培養(yǎng)基+丙酮)，以排除菌株自身的代謝產(chǎn)物、溶劑和培養(yǎng)基殘留成分的干擾，考察轉(zhuǎn)化液中是否存在非微生物引起的底物分解產(chǎn)物，并排除培養(yǎng)基成分和有機(jī)溶劑的影響。繼續(xù)培養(yǎng)5 d，得發(fā)酵液［11-12，17-18］。

發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，菌絲體用丙酮浸泡，過濾并合并有機(jī)相，減壓濃縮除去溶劑，TLC(薄層色譜法)檢測底物轉(zhuǎn)化情況［11-12，17］。

2 結(jié) 果

2.1 杜仲內(nèi)生真菌的種群組成及不同部位的分布

從杜仲的根、莖、葉中分離得到52株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)方法觀察 分屬目科屬表其中鐮孢霉屬最多，為9株，占17.31%;其次是交鏈孢霉屬，為8 株，占15.38%;莖點菌屬，為 7 株，占 13.46%;刺孢殼屬為 株 占 這 屬為杜仲的內(nèi)生真菌優(yōu)勢屬，占總數(shù)的57.69%。可見，杜仲內(nèi)生真菌在種類組成上具有多樣性。

表1 杜仲內(nèi)生真菌的構(gòu)成情況Tab 1 The composing of endophytic fungi in Eucommia ulmoides

杜仲植物內(nèi)生真菌在不同的部位分布不相同(表2)。從表1及表2還可以看出，不同部位杜仲內(nèi)生真菌的分布并不平均。從杜仲莖中分離出14株內(nèi)生真菌，占總菌株的26.92%，屬于7個屬;根中分離出16株內(nèi)生真菌，占總菌株的30.77%，屬于5個屬;葉中分離出22株內(nèi)生真菌，占總菌株的42.31%，屬于4個屬，其中鐮孢霉屬為優(yōu)勢屬，占總菌株的17.31%。

表2 內(nèi)生真菌在杜仲植物中的分布Tab 2 The distribution in number and species of endophytic fungi in Eucommia ulmoides

2.2 杜仲內(nèi)生真菌生物轉(zhuǎn)化活性篩選結(jié)果

分離得到的52株杜仲內(nèi)生真菌中，有4株內(nèi)生真菌對異甜菊醇具有轉(zhuǎn)化跡象(表3)，分別為交鏈孢霉Alternaria sp.EL3、瘤座霉 Tubercularia sp.ER3、鐮孢霉Fusarium sp.EL7及青霉Penicillium sp.ES2。其中交鏈孢霉Alternaria sp.和瘤座霉Tubercularia sp.對異甜菊醇的生物轉(zhuǎn)化此前未見文獻(xiàn)報道。

表 杜仲內(nèi)生真菌對異甜菊醇的生物轉(zhuǎn)化活性篩選Tab 3 Screening of biotransformation of isosteviol by endophytic fungi in Eucommia ulmoides

3 結(jié) 論

本研究從杜仲的根、莖、葉中分離到了52株內(nèi)生真菌，經(jīng)初步鑒定，分屬于2綱，2目，4科，10屬。其中莖部有14株(占總菌株的26.92%)，屬于7個屬(占10個屬的70%);根部有16株(30.77%)，屬于5個屬(50%);葉部有22株(42.31%)，屬于4個屬(40%)。

杜仲內(nèi)生真菌對異甜菊醇的生物轉(zhuǎn)化活性篩選結(jié)果顯示，52株內(nèi)生真菌中有4株能夠?qū)Ξ愄鹁沾歼M(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，且交鏈孢霉Alternaria sp.和瘤座霉Tubercularia sp.對異甜菊醇的生物轉(zhuǎn)化之前沒有報道，說明內(nèi)生真菌對異甜菊醇的生物轉(zhuǎn)化具有較好的研究前景。對于內(nèi)生真菌對異甜菊醇的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的情況，我們還將繼續(xù)深入研究。

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