磁性殼聚糖納米介導(dǎo)eNOS基因轉(zhuǎn)染受損平滑肌細(xì)胞初探

陳朝婷，高峰，陸平，蔡文瑋，盛凈

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院老年病科，上海 200011;2.上海交通大學(xué)微納科學(xué)技術(shù)研究院，上海 200240)

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)后再狹窄的基因治療研究已取得一定進(jìn)展:通過(guò)合適的基因載體轉(zhuǎn)染內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因可以促進(jìn)一氧化氮(nitric oxide，NO)合成及分泌，抑制損傷后血管平滑肌細(xì)胞增生，調(diào)控再狹窄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1-3］。以往實(shí)驗(yàn)已證實(shí)了腺病毒載體基因轉(zhuǎn)染的高效性［4-5］，但其自我復(fù)制性和免疫原性限制其進(jìn)一步向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化［6-7］。本研究采用有良好生物兼容性、低免疫源性、可重復(fù)性及磁場(chǎng)靶向性等特點(diǎn)的殼聚糖納米磁性粒子耦合eNOS基因在外加磁場(chǎng)下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，并與腺病毒載體比較轉(zhuǎn)染可行性，以期為基因防治再狹窄的安全性和靶向性作進(jìn)一步探索。

1 材料與方法

1.1 主要化學(xué)試劑和儀器

化學(xué)試劑:FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水(上?；瘜W(xué)試劑公司);殼聚糖(90%脫乙?；?，上海生工)，18 MΩ·cm去離子水自制。原核表達(dá)載體 Puc13-eNOS(美國(guó) Massachusetts General Hospital的 Bloch醫(yī)師惠贈(zèng))，高效真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)(Inviotrogen)，重組腺病毒eNOS質(zhì)粒(AdCMV-eNOS)及pcDNA3.1-eNOS均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［8-9］。Dulbecco改良基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，Gibco BRL)，α-actin(DOKO)，RT-PCR試劑盒(Takara)，Trizol(Gibco BRL)。dNTP(Pharmacia)，DMSO(Amresco)，RT-PCR Kits(TaKaRa，Japanese)，兔抗人NOS3多克隆抗體(Santa Cruz)，鼠抗兔FITC(DAKO)。其余化學(xué)試劑都是分析純或國(guó)內(nèi)分裝。

儀器:透射電子顯微鏡(JEM-2010，JEOL Ltd.，Japan);傅立葉-紅外光譜儀(FT-IR，EQUINOX 55，BRUKER Ltd，German);熱重分析儀(TGA 7，Perkin Elmer，Inc.，USA);電泳儀(Hoeter，USA)，GIS-2800 凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);紫外分光光度計(jì)(BECKMAN DU-600，USA)，PCR 儀(Biometer，Germany)，倒置顯微鏡(Olympus，Japan)，生物顯微鏡(Nikon，Japan)，PCR 擴(kuò)增儀(Genius，USA)，CO2培養(yǎng)箱(Napco，USA)，低溫高速離心機(jī)(Beckman，USA)，核酸分析儀(Beckman，USA)。

1.2 方法

1.2.1 磁性殼聚糖(簡(jiǎn)稱(chēng)磁聚糖)納米eNOS基因載體的制備 由上海交通大學(xué)微納技術(shù)研究院制備提供:原位共沉淀法制備磁聚糖納米粒子，包被eNOS質(zhì)粒，制備得 pH=5、包封率為82.4%、質(zhì)量比為4∶1的磁聚糖-eNOS耦合體。

1.2.2 血管損傷后平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 建立SD大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后模型［8］，分別取受損側(cè)和對(duì)側(cè)正常頸總動(dòng)脈組織塊培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞，用含10%FCS的Dulbecco改良基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，Gibco BRL公司)培養(yǎng)，并以α-actin進(jìn)行免疫化學(xué)鑒定和比較。

圖2 平滑肌細(xì)胞α-actin免疫染色鑒定

1.2.3 MTT法檢測(cè)不同濃度磁聚糖對(duì)平滑肌細(xì)胞的毒副作用 用0.25%的胰蛋白酶消化平滑肌細(xì)胞制成2×105個(gè)·ml－1的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔接種200 μl，空白對(duì)照孔中只加入細(xì)胞培養(yǎng)基不加細(xì)胞，待生長(zhǎng)24 h 細(xì)胞貼壁后，分別加入0、10、20、40、80、100、120 mg·ml－1不同濃度的磁聚糖納米顆粒，各濃度設(shè)5個(gè)平行孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞培養(yǎng)板下放置0.2特斯拉的磁場(chǎng)，6 h更換培養(yǎng)基并去掉磁場(chǎng)，18 h后換液，48 h后加入濃度為5 mg·ml－1的MTT溶液20 μl，再培養(yǎng)4 h后吸干孔內(nèi)液體，加入DMSO 150 μl，酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm處的吸光度。按細(xì)胞生存率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值－空白組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值－空白組OD值)×100%的公式計(jì)算細(xì)胞生存率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.4 不同載體對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染 平滑肌細(xì)胞(第2代)培養(yǎng)到80%融合時(shí)，以2.0×106個(gè)的細(xì)胞密度接種 恒溫混合氣體(5%CO2和95%O2)環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，分別以AdCMV-eNOS、磁聚糖-eNOS耦合物和磁聚糖空載體各50 μl加入3 ml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中濾過(guò)后加入細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)板下放置0.1特斯拉的磁場(chǎng)，培養(yǎng)6 h后更換為10%FCS DMEM液繼續(xù)培養(yǎng)。所有轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5 免疫熒光染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染后血管平滑肌細(xì)胞中eNOS蛋白的表達(dá) 上述轉(zhuǎn)染的3組細(xì)胞傳代時(shí)，將經(jīng)高錳酸鉀和濃硫酸預(yù)處理過(guò)的蓋玻片放入培養(yǎng)皿底部，使細(xì)胞在其上生長(zhǎng)，72 h后取出細(xì)胞爬片以兔多克隆抗人eNOS抗體(1∶100)和鼠抗兔免疫熒光抗體(1∶100)免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀(guān)察3組eNOS的蛋白表達(dá)。

1.2.6 磁聚糖載體介導(dǎo)eNOS基因的轉(zhuǎn)染效率及對(duì)eNOS mRNA表達(dá)的影響 同上方法轉(zhuǎn)染48 h后收集3組細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀488 nm激發(fā)光激發(fā)，檢測(cè)到綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分率，即為轉(zhuǎn)染效率。

3組轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)各組eNOS的mRNA表達(dá)。相應(yīng)引物由上海申能博彩公司合成，eNOS為450 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，凝膠分析系統(tǒng)分析圖像。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后血管平滑肌細(xì)胞周期

血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)轉(zhuǎn)染重復(fù)感深度(MOI)為100的AdCMV-eNOS病毒、磁聚糖-eNOS耦合物和磁聚糖空載體，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，消化收集細(xì)胞于測(cè)定管中，快速注入75%乙醇固定沉淀細(xì)胞。PBS洗 2 次，離心，棄上清，加 0.1 mg·ml－1RNase 100 μl，37℃水浴30 min，PBS洗2次，加入碘化丙錠(PI)染液0.5 ml，4℃避光30 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 磁聚糖-eNOS基因耦合體的部分表征

2.1.1 包封率的測(cè)定 將 pH 值分別為 4、5、6、7、8、9的磁聚糖基因納米混懸液于高速冷凍離心機(jī)上4℃、10 000×g離心1 h，吸取上清液10 μl，用去離子水稀釋50倍，混勻后加入石英比色杯中，紫外分光光度計(jì)檢測(cè) 處的吸光度 按公式包封率(W總－W游)/W總×100%(W總為殼聚糖納米粒溶液中總的DNA含量，W游為殼聚糖納米粒中游離的DNA量)計(jì)算得到包封率。當(dāng)pH為5時(shí)，包封率最高可達(dá)82.4% ，DNA 最大結(jié)合量可以達(dá)到 9.5 μg·ml－1。

2.1.2 電泳分析 將pH=5的磁聚糖-eNOS納米混合液經(jīng)磁分離，分別收集上清液和磁粒子在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察拍攝，結(jié)果見(jiàn)圖1。加上清液的第2、3泳道無(wú)條帶，表明基因DNA幾乎都與殼聚糖包裹磁性納米粒子結(jié)合，上清液中幾乎不存在基因DNA;加磁粒子的第4、5泳道及加eNOS質(zhì)粒對(duì)照的第6、7泳道上均有條帶顯示，但位置不同，可見(jiàn)基因DNA已結(jié)合到殼聚糖包裹磁性粒子上。

圖1 磁聚糖-eNOS納米混合液的組分電泳圖

2.2 血管損傷后平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)鑒定

血管損傷后平滑肌細(xì)胞于3～5 d由組織塊爬出，14～21 d爬滿(mǎn)。用細(xì)胞爬片進(jìn)行α-actin免疫化學(xué)鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，球囊損傷后血管平滑肌細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋單克隆抗體α-actin結(jié)合的抗體少于正常血管平滑肌細(xì)胞。

2.3 磁聚糖納米顆粒對(duì)平滑肌細(xì)胞的毒副作用

MTT法檢測(cè)不同濃度的磁聚糖納米顆粒對(duì)正常及受損后平滑肌細(xì)胞的毒副作用，結(jié)果(圖3)顯示在濃度為 0、5、10、20、40、80 mg·ml－1時(shí)磁聚糖納米顆粒對(duì)正常及受損平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)均無(wú)明顯影響，在160 mg·ml－1時(shí)對(duì)正常和受損后平滑肌細(xì)胞的抑制率分別為19.37%和16.24%。提示磁聚糖納米顆粒濃度在低于20 mg·ml－1范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。

圖3 不同濃度磁性殼聚糖對(duì)平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)的毒副作用

2.4 轉(zhuǎn)染后血管平滑肌細(xì)胞中eNOS蛋白的表達(dá)

AdCMV-eNOS和磁聚糖-eNOS耦合物轉(zhuǎn)染組受損平滑肌細(xì)胞免疫熒光染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，后者平滑肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度弱于前者，而磁聚糖空載體轉(zhuǎn)染組呈陰性反應(yīng)。見(jiàn)圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染后血管平滑肌細(xì)胞中eNOS蛋白免疫熒光檢測(cè)

2.5 轉(zhuǎn)染效率及對(duì)eNOSmRNA表達(dá)的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)磁聚糖-eNOS耦合物的轉(zhuǎn)染效率為(58.7±3.6)%，較AdCMV-eNOS的轉(zhuǎn)染效率［(78.1±2.5)%］低。

用RT-PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AdCMV-eNOS病毒和磁聚糖-eNOS耦合物轉(zhuǎn)染組均檢測(cè)出eNOSmRNA的表達(dá)條帶，而磁聚糖空載體轉(zhuǎn)染組為陰性，表明磁聚糖載體同樣能成功將目的基因轉(zhuǎn)染于平滑肌細(xì)胞中并有表達(dá)。見(jiàn)圖5。

圖5 RT-PCR檢測(cè)不同載體介導(dǎo)eNOS基因轉(zhuǎn)染的鑒定

2.6 轉(zhuǎn)染后血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，AdCMV-eNOS和磁聚糖-eNOS兩組轉(zhuǎn)染3 d后的血管平滑肌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞較磁聚糖空載體組明顯增多，S/G2-M期細(xì)胞減少，3組的凋亡率差異不顯著，提示磁聚糖-eNOS與AdCMV-eNOS轉(zhuǎn)染都能使血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞增殖周期延緩阻滯 但不影響細(xì)胞凋亡

表1 轉(zhuǎn)染后血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測(cè)±s)%

表1 轉(zhuǎn)染后血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測(cè)±s)%

與磁聚糖空載體轉(zhuǎn)染組比較，a P＜0.01

組 別細(xì)胞周期G0/G1 S/G2-M 凋亡率AdCMV-eNOS轉(zhuǎn)染組 75.3±1.4a 24.7±1.6a 4.72±1.8磁聚糖-eNOS轉(zhuǎn)染組 68.9±2.3a 31.1±3.1a 4.96±2.5磁聚糖空載體轉(zhuǎn)染組43.6±8.7 4.2±9.3 4.77±2.7

3 討 論

隨著PTCA的廣泛開(kāi)展，高達(dá)30%以上的冠狀動(dòng)脈術(shù)后再狹窄(restenosis，RS)的發(fā)生率也成為關(guān)注的焦點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為新生內(nèi)膜形成和血管重塑是再狹窄的重要病理機(jī)制，而血管平滑肌細(xì)胞在此過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［1］。因此，從基因治療角度調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡，是防治再狹窄的一個(gè)重要方面。

近年的研究發(fā)現(xiàn)NO可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移，而NOS作為NO合成的關(guān)鍵酶，可以提高NO的活性，增加NO的合成，因而通過(guò)eNOS基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)NOS表達(dá)［2-3］，對(duì)防治損傷后血管內(nèi)膜新生和再狹窄發(fā)生具有重要作用。

基因載體選擇是基因治療中的一個(gè)關(guān)鍵。理想的基因載體［9］應(yīng)具備以下特點(diǎn):(1)靶向特異性，且被免疫系統(tǒng)識(shí)別;(2)高度穩(wěn)定，易制備、濃縮和純化;(3)無(wú)毒副作用;(4)基因能夠高效轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期表達(dá)。病毒載體因其轉(zhuǎn)移表達(dá)高效穩(wěn)定被約80%的基因研究所選擇［5］，但安全性一直是其臨床應(yīng)用的障礙。

殼聚糖非病毒載體是一種天然存在的甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，具有良好的生物相容性、降解性、低免疫原性、無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低、靶向性不好的缺點(diǎn)［10］。磁聚糖納米材料［11-13］具有較高的正電性能吸附帶有負(fù)電的質(zhì)粒DNA，并通過(guò)Fe304磁核在外加磁場(chǎng)的作用下作定向移動(dòng)，因而可以靶向性增強(qiáng)目的基因的攝取。

本研究將磁聚糖載體耦合eNOS基因質(zhì)粒在體外對(duì)血管平滑肌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)正常濃度范圍內(nèi)該載體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯毒副作用，雖然比重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染率較低，但同樣可獲基因成功轉(zhuǎn)染和表達(dá)，并抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖周期。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，磁聚糖載體在耦合基因質(zhì)粒時(shí)易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象 調(diào)整合適的混懸液pH值及載體質(zhì)粒質(zhì)量比是獲得穩(wěn)定可靠納米級(jí)基因耦合物的關(guān)鍵。此外，實(shí)驗(yàn)外加磁場(chǎng)強(qiáng)度和作用時(shí)間有利于提高轉(zhuǎn)染效率，可以進(jìn)行更深入的比較分析，并逐步開(kāi)展支架磁化預(yù)處理及體內(nèi)轉(zhuǎn)染條件的摸索，為防治再狹窄的臨床轉(zhuǎn)化作進(jìn)一步探索。

［1］HORLITZ M，SIGWART U，NIEBAUER J.Fighting restenosis after coronary angioplasty:contemporary and future treatment options［J］.Int J Cardiol，2002，83(3):199-205.

［2］JANSSENS S，F(xiàn)LAHERTY D，NONG Z，et al.Human endothelial nitric oxide synthase gene transfer inhibits vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation after balloon injury in rats［J］.Circulation，1998，97(13):1274-1281.

［3］CHEN A F，REN J，MIAO C Y.Nitric oxide synthase gene therapy for cardiovascular disease［J］.Jpn J Pharmacol，2002，89(4):327-336.

［4］ZHANG W W.Development and application of adenoviral vector gene therapy of cancer［J］.Cancer Gene Ther，1999，6(2):113-389.

［5］VORBURGER S A，HUNT K K.Adenoviral gene therapy［J］.Oncologist，2002，7(1):46-59.

［6］KOPP C W，de MARTIN R.Gene therapy approaches for the prevention of restenosis［J］.Curr Vasc Pharmacol，2004，2(2):183-189.

［7］KIM S E，PARK J H，CHO Y W，et al.Porous chitosan scaffold containing microspheres loaded with transforming growth factor beta 1:implications for cartilage tissue engineering［J］.J Control Release，2003，91(3):365-374.

［8］TAKAKURA Y，NISHIKAWA M，YAMASHITA F.Influence of physicochemical properties on pharmacokinetics of non-viral vectors for gene delivery［J］ J Drug Target，2002，10(2):99-104.

［9］陸平，蔡文瑋，盛凈，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定［J］.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(9):717-719.

［10］蔡文瑋，陸平，盛凈.eNOS基因體外轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后血管平滑肌細(xì)胞增殖規(guī)律的影響［J］.中國(guó)微循環(huán)，2005，9(4):251-255.

［11］蒲曉輝，張曉，孫進(jìn)，等.納米混懸劑的應(yīng)用及體內(nèi)外行為研究進(jìn)展［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，30(4):1671-6264.

［12］KUZNETSOV A A，F(xiàn)ILIPPOV V L，KUZNETSOV O L，et al.New ferro-carbor absorbents for magnetically guided transport of anti-cancer drugs［J］.J Magn Magn Mater，1999，194:22-30.

［13］KIMA E H，AHNB Y，LEE H S.Biomedical applications of superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated within chitosan［J］.J Alloys Compd，2007，434/435:633-636.