乳腺癌組織中ADAM8 mRNA 的表達及意義

單海琳，李俊生，邵清

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院普外科，江蘇江陰 214400;2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院普外科，江蘇南京 210009)

乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，經(jīng)過血道和淋巴道轉(zhuǎn)移是患者的主要死亡原因，但其分子機制尚未充分闡明。目前普遍認為乳腺癌的預(yù)后與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管生成狀況及治療措施等密切相關(guān)。在腫瘤轉(zhuǎn)移研究中，已認識到解整合素-金屬蛋白酶(adisintegrin and metalloproteases，ADAMs)［1］在腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移中起重要作用，但在乳腺癌領(lǐng)域?qū)庹纤亟饘俚鞍酌?(ADAM8)研究相對較少。本實驗采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)，聯(lián)合檢測乳腺癌組織中ADAM8的表達及其與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2003年6月至2009年7月東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬江陰醫(yī)院手術(shù)切除、經(jīng)HE染色及病理組織學(xué)證實，并經(jīng)兩位以上有經(jīng)驗的病理醫(yī)師復(fù)查確診為乳腺癌的標本39例，所有患者臨床及病理資料齊全，術(shù)前均無放射治療、化學(xué)治療及免疫治療史。所有標本在無壞死癌灶內(nèi)取材?；颊呔鶠榕裕挲g27～71歲，中位年齡46歲，平均(46.6±5.9)歲。按WHO腫瘤病理學(xué)及遺傳學(xué)分類(2004年)行病理組織學(xué)分類及病理分級，病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌。按國際抗癌聯(lián)盟UICC提出的TNM分期(2003年):Ⅰ期10例，Ⅱ期23例，Ⅲ期6例。局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況:無轉(zhuǎn)移21例，有轉(zhuǎn)移18例。對照組為同期手術(shù)的19例乳腺正常組織標本，取自乳腺良性病變(如纖維腺瘤、乳腺腺病)的手術(shù)切緣，經(jīng)病理確診無顯著病變?；颊呔鶠榕?，年齡25～68歲，中位年齡43歲，平均(41.4±5.1)歲。兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。所有標本均在離體后立即用預(yù)冷l‰DEPC洗滌后，置于經(jīng)1‰DEPC浸泡處理、高溫高壓滅活的EP管內(nèi)，－70℃液氮冷凍保存。

1.2 試劑與儀器

Trizol試劑(上海生工生物工程有限公司)，UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒(TOYOBO)，普通PCR 試劑盒(TOYOBO)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix QPK-201試劑盒(TOYOBO)，DNA Marker(TaKaRa)，Mastercycler PCR儀(艾本德進口)，Mastercycler ep realplex PCR儀 (艾本德進口)和紫外分光光度儀(Beckman)

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)基因庫中ADAM8序列，用 Gene Tool軟件設(shè)計特異引物，上下游引物跨越一個內(nèi)含子以避免基因組污染影響結(jié)果。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計，ADAM8:上游引物5'-GCGCACGGTACCTGCTG CCAGG-3'，長 度 22 bp，下 游 引 物 5'-GGGACGGCA CAGCTCACCAGCC-3'，長度 22 bp;β-actin:上游引物，長度 24 bp，下游引物5'-TGGGGTGGCTTTTAGGATGGCA-3'，長度22 bp。

1.4 模板RNA提取

按照Trizol RNA提取試劑盒說明書的流程抽提標本中的總RNA。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)

RT反應(yīng)按照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT試劑盒說明書進行操作。取提取的總RNA樣品，每個樣品取出7 μl進行逆轉(zhuǎn)錄實驗。把 RNA在65℃條件下溫浴5 min后，立即放于冰上冷卻。按反應(yīng)體系加入 5 × RT buffer 2 μl，RT Enzyme Mix 0.5 μl，Primer Mix 0.5 μl置PCR儀中。反應(yīng)條件為37℃15 min，98℃ 5 min，4℃ 保溫。所得產(chǎn)物置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PCR 反應(yīng)

PCR 擴增體系 25 μl:DEPC 水 17.5 μl，10 × Taq buffer 2.5 μl，MgCl22.0 μl，10 mol·L－1dNTP Mix 0.5 μl，上游引物 0.5 μl，下游引物 0.5 μl，Taq 酶(5 U·μl－1)0.5 μl，總 CDNA 1.0 μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，67.5 ℃ 30 s，72 ℃30 s，31個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保溫。

1.7 電泳

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶的數(shù)量和分子質(zhì)量大小判斷產(chǎn)物的特異性。取9 μl產(chǎn)物與1 μl上樣緩沖液混勻后上樣于1%瓊脂糖凝膠，110 V恒壓電泳20 min，UVP成像系統(tǒng)觀察。

1.8 QRT-PCR

采用SYBR Green I熒光染料QRT-PCR檢測方法。每份標本設(shè)3個平行對照反應(yīng)孔，以β-actin作為參照，ADAM8作為目的基因，與相應(yīng)標準品一起擴增。ADAM8 mRNA的測定陽性定量標準品及待測樣品均按以下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行擴增。PCR擴增體系 50 μl:蒸餾水 16 μl，SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 25 μl，上游引物 (10 μmol·L－1)2 μl，下游引物(10 μmol·L－1)2 μl，樣品溶液 5 μl。循環(huán)條件(三步法):95 ℃ 20 s，95 ℃ 15 s，67.5 ℃ 20 s，72 ℃20 s，共40個循環(huán)。得到標本中ADAM8與β-actin的循環(huán)閾值(Ct)，通過溶解曲線確定PCR產(chǎn)物的特異性。

1.9 標準曲線的制備

將1份ADAM8與β-actin cDNA標準品分別用滅菌雙蒸水稀釋至 10－1、10－2、10－3、10－4倍，與待測樣品在同樣反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行擴增。反應(yīng)結(jié)束后，電腦自動分析熒光信號并將其轉(zhuǎn)換為起始拷貝數(shù)及Ct值，由定量分析軟件分別制作目的基因和內(nèi)參照的標準曲線。

1.10 結(jié)果判定標準

采用QRT-PCR方法檢測，以β-actin作為內(nèi)參照，ADAM8作為目的基因。ADAM8mRNA減去β-actin的Ct值得到△Ct值，以正常乳腺組織△Ct值的平均數(shù)作為矯正數(shù)，計算 2－△△Ct值，以 2－△△Ct值為 RNA 表達量［2］。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，各組間的比較采用非參數(shù)統(tǒng)計中Mann-Whitney檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 方法的可靠性及準確性

2.1.1 ADAM8 cDNA擴增產(chǎn)物電泳 PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到乳腺癌組織和良性乳腺組織中ADAM8 60 bp特異性擴增條帶，條帶清晰可見，無引物二聚體，無明顯降解(圖1)。

圖1ADAM8cDNA擴增產(chǎn)物電泳Fig 1 ADAM8cDNA amplification products electrophoresis

2.1.2 擴增的特異性及定量的準確性 標準品cDNA經(jīng)梯度稀釋后進行PCR反應(yīng)，制作標準曲線(圖2)。得到的Ct值與起始模板濃度對數(shù)呈線性關(guān)系，證實了用Ct值進行定量的準確性。ADAM8線性方程為y=－3.267x+14.83，r2=0.998 9，擴增效率 1.023。β-actin線性方程為 y= －3.416x+15.605，r2=0.998 6，擴增效率1.079。r2均＞0.998，擴增效率近似，反映定量準確，擴增效率良好。β-actin 4個濃度梯度的擴增曲線間距相等，表示梯度濃度稀釋準確(圖3、4)。擴增后進入溶解程序生成溶解曲線，溶解曲線顯示銳利的單一鋒，無其他非特異性鋒，說明擴增產(chǎn)物均一，無非特異擴增及引物二聚體(圖5、6)。

圖2 ADAM8與β-actin標準曲線圖Fig 2 Standard curve of ADAM8 and β-actin

圖3 β-actin擴增曲線Fig 3 Amplification curve of β-actin

圖4ADAM8 mRNA的擴增曲線Fig 4 Amplification curve of ADAM8 mRNA in breast tissue

圖5 β-actin溶解曲線圖Fig 5 Melting curve of β-actin

圖6 ADAM8溶解曲線Fig 6 Melting curve of ADAM8 mRNA in breast tissue

2.2 ADAM8 mRNA在乳腺癌與良性乳腺組織中的表達

ADAM8 mRNA在乳腺癌和正常乳腺組織中均有表達，但ADAM8 mRNA在乳腺癌組織中的表達水平低于正常乳腺組織(P=0.015);而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達水平低于無轉(zhuǎn)移組，Ⅰ+Ⅱa期表達水平低于Ⅱb+Ⅲ期，但表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 ADAM8 mRNA在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達水平Tab 1 The expression of ADAM8 mRNA in breast cancer and normal breast tissues

3 討 論

ADAMs為錨定于細胞膜的細胞表面蛋白質(zhì)家族，是近年來發(fā)現(xiàn)的具有金屬蛋白酶和整合素兩種結(jié)構(gòu)域的物質(zhì)，迄今文獻報道已有30多種［3］，它們在調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(ECM)的重塑和細胞遷移中起著重要的作用［4］，并參與表皮生長因子受體(EGFR)配體胞外功能區(qū)的脫落。

越來越多的研究表明ADAMs在乳腺癌發(fā)生和演化中起重要作用 目前研究發(fā)現(xiàn)28表達與乳腺癌相關(guān)。Rocks等［5］發(fā)現(xiàn)ADAM9的表達水平與他莫西芬治療乳腺癌的效果相關(guān)，可以作為乳腺癌的治療新靶點。國內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)ADAM9還與結(jié)腸癌的疾病進展有關(guān)，并與腫瘤血管形成有相關(guān)性［6］。Kuefer等［7］在組織微陣列實驗中發(fā)現(xiàn) ADAM15蛋白在多種腺癌中表達增高，特別與乳腺癌的轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，其表達水平隨乳腺癌的分級分期增高而增加。McGowan等［8］發(fā)現(xiàn) ADAMl7 mRNA及蛋白水平在乳腺癌組織中表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)目呈正相關(guān)，其過表達可增加細胞侵襲和增殖，而靶向作用于ADAMl7，阻止轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)和雙調(diào)蛋白的脫落，可恢復(fù)乳腺癌細胞的惡性表型。另外，體內(nèi)外試驗顯示ADAM28選擇性表達于人乳腺癌細胞，并且可通過增強IGF-l的生物利用度促進乳腺癌細胞增殖［9］。上述研究結(jié)果表明，多種ADAMs基因家族參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、凋亡及侵襲等多個過程。

據(jù)報道ADAM8在多種實體瘤組織中存在過度表達，常與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)［10］，但ADAM8在乳腺癌中的表達國內(nèi)外相關(guān)的文獻報道并不多。本研究用SYBR GreenⅠ染料法初步檢測36例乳腺癌及19例正常乳腺組織中ADAM8表達水平，結(jié)果提示乳腺癌組織及正常乳腺組織中均可檢測到ADAM8 mRNA表達，但其在乳腺癌組織中表達下調(diào)，表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，此前尚未見到同類研究報道。我們進一步的研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的乳腺癌組織ADM8 mRNA表達水平低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，隨著腫瘤浸潤的加深，ADM8 mRNA表達水平下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量較小有關(guān)，但亦暗示ADAM8在進展及轉(zhuǎn)移乳腺癌中的表達存在一致性的下調(diào)，本研究首次表明ADM8 mRNA表達下調(diào)可能與乳腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。這與Alexe等［11］在乳腺癌亞型微陣列分層研究的結(jié)果一致，Alexe等發(fā)現(xiàn)從原位癌到浸潤性乳腺癌進展的各個階段，不同級別及亞型中腫瘤基因表達存在異質(zhì)性，在浸潤性及轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中ADAM8表達下調(diào)，而 MMP11，ADAM12表達上調(diào)。另外Guaiquil等［12］采用氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(OIR)模型和腫瘤細胞異體植入研究ADAM8對小鼠病理性血管再生的作用，發(fā)現(xiàn)在OIR模型中，乏ADAM8小鼠與野生型比較，視網(wǎng)膜病理性再生血管叢減少，異體植入腫瘤細胞增生較快。研究結(jié)果表明，抑制ADAM8的表達可用于促進有益血管再生，從而防止增殖性視網(wǎng)膜病變形成?，F(xiàn)有研究提示ADAM8在不同腫瘤中的表達可能不同，如Ishikawa等［13］研究表明，ADAM8在肺癌中存在表達，免疫組化結(jié)果顯示人ⅢB/Ⅳ期肺癌較Ⅰ～ⅢA期表達明顯增高，通過基質(zhì)膠侵襲分析提示轉(zhuǎn)染了ADAM8 cDNA的肺癌細胞株NII-13T3和COS-7侵襲活性明顯強于轉(zhuǎn)染模擬噬菌體的細胞株，提示ADAM8的蛋白水解酶的活性有利于腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。吳國成等［14］在肺癌研究的報道類似，ADAM8在非小細胞肺癌的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期存在相關(guān)性，分期越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越明顯，其表達越強。Wildeboer等［10］采用 RT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，ADAM8在原發(fā)性腦腫瘤中其mRNA表達明顯增高，ADAM8表達水平和蛋白水解酶的活性與惡性膠質(zhì)瘤細胞侵入活性的相關(guān)性，提示ADAM8在上述腫瘤轉(zhuǎn)移上發(fā)揮重要作用。Valkovskaya等［15］用定量RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，胰腺導(dǎo)管腺癌中ADAM8 mRNA相對于正常胰腺組織表達明顯增高，且高水平mRNA和高蛋白表達與存活時間呈負相關(guān)。沉默ADAM8基因表達能抑制其侵襲性，且細胞培養(yǎng)液上清的腫瘤細胞蛋白水解酶活性明顯下降。本研究結(jié)果首次表明，ADAM8的表達缺失或者下調(diào)可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起作用，提示ADAM8在不同腫瘤中的作用具有個體性，可能與ADAMs特別的剪切膜表面蛋白功能有關(guān)，它在細胞因子和生長因子作用過程中調(diào)節(jié)影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移。ADAM8過表達促進在血管再生中發(fā)揮作用的幾種膜蛋白胞外功能區(qū)的脫落(CD31的，Tie-2，F(xiàn)lk-1 和 Flt-1，EphrinB2，EphB4，VE-鈣粘蛋白，KL-1，E-選擇素和調(diào)節(jié)素-1beta2)［12］。因此，體內(nèi)血管內(nèi)皮細胞ADAM8表達失調(diào)可能潛在增加這些底物蛋白加工。但ADAMs家族在多個領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，如細胞融合、細胞凋亡、遷移以及受精等過程，其具體機制是復(fù)雜的，而乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多因素參與的復(fù)雜過程，因此ADAM8表達抑制對乳腺癌疾病進展的作用及其機制尚有待于更深入的研究。我們認為，進一步擴大樣本，以及追蹤患者病情的演變和預(yù)后，揭示ADAM8的表達水平與乳腺癌臨床分期的確切關(guān)系，并進行功能實驗研究，對于闡明該基因與乳腺癌發(fā)病的關(guān)系，以及對乳腺癌的診斷、預(yù)后判斷和治療可提供新的思路。

［1］WOLFSBERG T G，WHITE J M.ADAMs in fertilization and development［J］.Developmental Biology，1996，180(2):389-401.

［2］KENNETH J L，THOMAS D S.Analysis of relative gene expression datausing real-timequantitativePCR and the 2-△△t［J］.Methods，2001，25:402-408.

［3］MOCHIZUKI S，OKADA Y.ADAMs in cancer cell proliferation and progression［J］.Cancer Sci，2007，98(5):621-628.

［4］SEALS D F，COURTNEIDGE S A.The ADAMs family of metalloproteases;multidomain proteins with multiple functions［J］.Genes Dev，2003，17(1):7-30.

［5］ROCKS N，PAULISSEN G，QUESADA C F，et al.Expression of a disintegrin and metalloprotease(ADAM and ADAMTS)enzymes in human nonsmallcell lung carcinomas(NSCLC)［J］.Br J Cancer，2006，94(5):724-730.

［6］施文，李俊生.結(jié)腸癌組織中ADAM9的表達及其與微血管密度的關(guān)系［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2009，28(4):274-278.

［7］KUEFER R ，DAY K C，KLEER C G，et al.ADAM15 disintegrin is associated with aggressive prostate and breast cancer disease［J］.Neoplasia，2006，8(4):319-329.

［8］McGOWAN P M，RYAN B M，HILL A D，et al.ADAM-17 expression in breast cancer correlates with variables of tumor progression［J］.Clin Cancer Res，2007，13(8):2335-2343.

［9］MITSUI Y，MOCHIZUKI S，KODAMA T，et al.ADAM28 is overexpressed in human breast carcinomas:implications for carcinoma cell proliferation through cleavage of insulin-like growth factor binding protein-3［J］.Cancer Res，2006，66(20):9913-9920.

［10］WILDEBOER D，NAUS S，AMY-SANG Q X，et al.Metalloproteinase disintegrins ADAM8 and ADAM19 are highly regulated in human primary brain tumors and their expression levels and activities are associated with invasiveness［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2006，65(5):516-527.

［11］ALEXE G，DALGIN G S，SCANFELD D，et al.Breast cancer stratification from analysis of micro-array data of micro-disssected specimens［J］.Genome Inform，2007，18:130-140.

［12］GUAIQUIL V H，SWENDEMAN S，ZHOU W，et al.ADAM8 is a negative regulator of retinal neovascularization and of the-ADAM8 growth of heterotopically injected tumor cells in mice［J］.Mol Med，2010，88(5):497-505.

［13］ISHIKAWA N，DAIGO Y，YASUI W，et al.ADAM8 as a novel serological and histochemical marker for lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10(24):8363-8370.

［14］吳國成，胡華成，施敏驊.ADAM8、EGFR在非小細胞肺癌中的表達及其相關(guān)性［J］.癌癥，2008，27(8):874-878.

［15］VALKOVSKAYA N，KAYED H，F(xiàn)ELIX K，et al.ADAM8 expression is associated with increased invasiveness and reduced patient survival in pancreatic cancer［J］.J Cell Mol Med，2007，11(5):1162-1174.