COX-2信號(hào)通路參與高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大研究

李勁松

(重慶市雙橋區(qū)人民醫(yī)院 400900)

糖尿病是當(dāng)前世界的流行性疾病之一,糖尿病在世界范圍內(nèi)的流行趨勢(shì)日趨嚴(yán)重[1]。有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病本身可引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷,出現(xiàn)以心肌肥厚、心室順應(yīng)性降低和峰充盈率減少為主要特征的糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)[2-3]。心肌肥厚是糖尿病性心肌病關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)改變,與糖尿病患者心力衰竭、猝死等密切相關(guān)[4-5]。環(huán)氧化酶(COX)是由花生四烯酸合成前列腺素(prostaglandin,PGs)的限速酶,分為COX-1和 COX-2兩種,COX-1組成性表達(dá),存在于正常組織中,一般濃度較低,外源性刺激不能誘導(dǎo)其表達(dá);COX-2在內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞中,可受活性氧中間產(chǎn)物誘導(dǎo)性表達(dá),并參與氧化應(yīng)激過程,其產(chǎn)物在炎癥等病理過程中起重要作用[6-9]。有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病是一種與炎癥有關(guān)的疾病,IL-1β 、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種促炎性細(xì)胞因子參與了糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程[10]。COX-2特異性抑制劑——賽來昔布是否可以抑制糖尿病心肌肥厚,目前尚未見相關(guān)報(bào)道?，F(xiàn)將本研究利用高糖高胰島素作為刺激因子,在離體培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行的相關(guān)研究報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1～3 d齡的SD乳鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 賽來昔布、多聚甲醛、PVDF膜購自Sigma公司,RIPA裂解液、BCA蛋白試劑盒購自江蘇碧云天公司,PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TRIzol購自TaKaRa生物工程公司,DMEM 培養(yǎng)基購自Gbico公司,胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.3 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)[11]將乳鼠心臟剪成1 mm3左右小塊,加0.125%的胰蛋白酶為單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至(0.25～0.65)×108cells/L接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,檢測(cè)細(xì)胞表面積;調(diào)整細(xì)胞濃度至(2.5～3.5)×108cells/L,接種于 25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),檢測(cè) mRNA;接種于 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,檢測(cè)蛋白含量。置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。心肌細(xì)胞在18～30 h后可貼壁生長(zhǎng),在48 h后出現(xiàn)自發(fā)搏動(dòng)。開始培養(yǎng)時(shí)加入0.1 mmol/L 5￠-BrdU抑制非心肌細(xì)胞生長(zhǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,至72 h換無血清培養(yǎng)液并加入相應(yīng)試藥,繼續(xù)孵育48 h后用于檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分為3組,(1)對(duì)照組:葡萄糖5.5 mmol/L;(2)模型組:葡萄糖25.5 mmol/L加胰島素0.1 μ mol/L;(3)實(shí)驗(yàn)組:在模型組的基礎(chǔ)上加用賽來昔布 0.3 μ mol/L。

1.5 心肌細(xì)胞表面積測(cè)量 取有心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的蓋玻片,用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,95%的乙醇固定13～18 min,HE染色后用 QwinV3圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的表面積,每張玻片測(cè)量10個(gè)視野,每個(gè)視野測(cè)20～25個(gè)細(xì)胞,取均值。每組重復(fù)6次。

1.6 心肌細(xì)胞蛋白濃度的測(cè)定 收集心肌細(xì)胞,加入裂解液,在冰浴條件下用超聲破碎儀破碎細(xì)胞,4℃10 000 r/min離心10 min,取上清液按照BCA蛋白檢測(cè)試劑盒說明書操作,用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算心肌細(xì)胞的蛋白含量。

1.7 檢測(cè)心房利鈉因子(ANF)、COX-2 mRNA的表達(dá) 用real-time PCR,引物序列如下:ANF正義鏈5′-TCA CTG GAT TGG AGC CAA GAG-3′,反義鏈 5′-TCC TGC AGA TAT GGT GTT T TC TAC-3′;COX-2 正義鏈 5′-GAA TCA CTC ATC AGC GCA TCA C-3′,反義鏈 5′-CTA GAC AGT ACG CGC TCC AGA TAC-3′;β-actin 正義 鏈 5′-GCC CTA CGG TCA A TA CAT GA-3′,反義鏈 5′-CTG CGT GGT TCC CT T CGT AGA-3′。 擴(kuò)增 片段 分別 為 75、162、423 bp。 引物 由TaKaRa生物工程公司合成。擴(kuò)增完成以后進(jìn)行凝膠電泳分離驗(yàn)證real-time PCR結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料以±s表示,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

3組高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大見表1,圖1。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)值(53.3±5.6和39.5±2.8)與模型組(135.8±11.4)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見圖 2。

圖1 高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大HE染色(×400)

表1 3組高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大比較(±s,n=6)

表1 3組高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大比較(±s,n=6)

★:P＜0.05,與對(duì)照組比較;☆:P＜0.05,與模型組比較。

組別 細(xì)胞表面積(μ m2/cell)蛋白含量(μ g/106cell) ANF mRNA對(duì)照組 398.5±51.2 20.6±3.8 31.2±5.9模型組 1 006.8±63.1★ 50.4±6.5★ 166.3±18.9★實(shí)驗(yàn)組 425.6±53.2☆ 29.4±3.6☆ 42.8±7.3☆

圖2 高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大凝膠電泳分離結(jié)果

3 討 論

心肌肥厚是2型糖尿病等代謝性疾病患者常見的并發(fā)癥,是糖尿病患者并發(fā)心力衰竭和猝死的根本原因[12-13]?；颊咴谔悄虿∏闆r下血糖升高,與此同時(shí)機(jī)體的調(diào)節(jié)機(jī)制促使胰島素分泌增加。雖然短期代償機(jī)制能有效降低血糖水平,但長(zhǎng)時(shí)間高血糖會(huì)干擾胰島素通路而降低其敏感性,從而影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),導(dǎo)致血糖水平和胰島素濃度持續(xù)升高,形成高糖高胰島素血癥。目前有文獻(xiàn)報(bào)道,高糖高胰島素亦可作為獨(dú)立的因素參與心肌肥大的形成[13-14]。本研究用0.1 μ mol/L胰島素與25.5 mmol/L葡萄糖刺激心肌細(xì)胞,模擬糖尿病患者高糖高胰島素血癥環(huán)境,發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞表面積、總蛋白含量和 ANF mRNA的表達(dá)均明顯升高,出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大。

Bell和McDermott[15]發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在心肌肥厚和糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中均起主要作用,提示糖尿病心肌肥厚的發(fā)生可能與促炎性細(xì)胞因子有一定相關(guān)性。COX-2是炎癥反應(yīng)過程中重要的促炎性細(xì)胞因子,可以催化花生四烯酸產(chǎn)生PGs,引起連鎖炎癥反應(yīng),COX-2的表達(dá)水平與炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[6],COX-2的表達(dá)時(shí)間也明顯早于TNF、IL-1和IL6等促炎性細(xì)胞因子。也有研究顯示,COX-2參與了心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過程,提示COX-2可能在糖尿病心肌肥厚中起重要作用。

本研究結(jié)果顯示,高糖高胰島素刺激心肌細(xì)胞肥大的同時(shí),COX-2 mRNA的表達(dá)明顯增加,二者呈正相關(guān),提示高糖高胰島素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大可能與其激活COX-2的表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步確定COX-2在心肌細(xì)胞肥大中的作用,本研究還采用了COX-2特異性阻斷劑——賽來昔布進(jìn)行了更深入的研究。結(jié)果表明,賽來昔布在抑制COX-2表達(dá)的同時(shí),可以對(duì)抗高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,進(jìn)一步證實(shí)COX-2參與了高糖高胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

綜上所述,本研究利用高糖高胰島素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型證明COX-2與其致肥大機(jī)制密切相關(guān),為糖尿病心肌肥厚的治療提供了新的思路和途徑,并為開發(fā)低毒高效、價(jià)格便宜的治療糖尿病心肌肥厚的藥物提供了基礎(chǔ)理論支持。

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