次烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞Ca2+調(diào)控蛋白mRNA表達(dá)的影響*

李志勇,譚 鵬,趙 暉,李 飛,孫建寧△

(1.中央民族大學(xué)中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院,北京100081;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京100012;3.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,北京100069)

含有烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿(hypaconitine,HA)等生物堿的天然藥物主要包括附子、川烏、草烏、雪上一枝蒿等藥材,因含有上述毒性成分在臨床應(yīng)用中極易發(fā)生中毒,損傷機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)與心血管系統(tǒng),最突出的體征為心律失常[1-4]。有研究顯示,HA在附子炮制品及中成藥中都有存在[5-8],且附子的毒-效表達(dá)與烏頭堿、中烏頭堿、HA在炮制過(guò)程中的差異配比存在相關(guān)性[9],HA在正常大鼠及離體心臟、原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞上都能引發(fā)嚴(yán)重心律失常[10-11]。現(xiàn)將HA對(duì)心肌細(xì)胞L-鈣通道α1C亞基、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白(CaM)及肌質(zhì)網(wǎng)上雷諾定受體(Ry R2)mRNA表達(dá)的影響報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥品 3 d乳大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)雌雄不拘,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2002-0003。HA;(中國(guó)食品藥品檢定研究院),批號(hào):200404,純度大于或等于98%,用二甲基亞砜(DMSO)溶解,制成貯備液。

1.2 試劑與儀器 達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基/F12(DMEM/F12)購(gòu)自美國(guó)sigma公司,批號(hào) 086K 83521;胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ型(CoⅡ)、四噻唑蘭(MTT)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA Na2)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;5-溴-2-脫氧尿核苷購(gòu)自Brd U,Roche公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司,批號(hào)071031;First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas公司,批號(hào) 00020634;SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自 Applied Biosystems公司,批號(hào)43049155。CJT型超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化設(shè)備公司;RCO-3000T-5V型CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)G.S.公司;DMILHC倒置相差顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司;YXOGO2型電熱式蒸汽消毒器購(gòu)自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;400R低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司;GeneAmp 5700 TaqMAN PCR儀購(gòu)自美國(guó)AppliedBiosystems公司;凝膠圖像分析儀、ImageMaster VDS購(gòu)自美國(guó)pharmacia Biotech公司;OYY-Ⅲ-5型電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠;YLD-2000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;HZQ-C空氣浴振蕩器購(gòu)自哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠。

表1 引物序列

1.3 方法

1.3.1 心肌細(xì)胞制備與培養(yǎng) 超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下取出乳鼠心臟,在預(yù)冷D-Hank′s液中清洗3～4次。將心肌組織剪為1 mm3大小,加入3倍體積量的消化酶(終濃度0.04%的胰酶和終濃度0.04%的CoⅡ混合液,用前混勻),放于 37℃,每分鐘30～40轉(zhuǎn)空氣浴振蕩10～20 min,反復(fù)至消化完全,除第1次外,收集各次消化后的上清液,加入等體積含10%胎牛血清的DMEM/F12終止消化,于4℃,1 000 r/min離心10 min,收集所有細(xì)胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,吹打成單細(xì)胞懸液,經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾去除未消化的組織塊。接種于25 cm2的卡式培養(yǎng)瓶中,置于 37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中,用差速貼壁法分離非心肌細(xì)胞,每次90 min,共2次。所得未貼壁細(xì)胞(心肌細(xì)胞)計(jì)數(shù),按 8×105cell/m L接種于6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)液中加入終濃度為0.1 mmol/L Brd U抑制成纖維細(xì)胞增殖,添加雙抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)預(yù)防細(xì)菌污染,37℃、5%CO2、91%濕度環(huán)境中培養(yǎng),約每36～48小時(shí)換1次培養(yǎng)液,培養(yǎng)3～4 d后使用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、HA 30μM/L組、HA 60μM/L組及HA 120μM/L組。

1.3.3 檢測(cè)心肌細(xì)胞 L-鈣通道α1C、CaM 及 Ry R2m RNA的表達(dá) 給藥前12 h更換無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液,分別將30、60、120μM/L HA與心肌細(xì)胞共同孵育15 min后棄含藥培養(yǎng)液,用 D-Hank′s液清洗 2～ 3次。 同時(shí),將 HA 30、60 μM/L組心肌細(xì)胞與HA共同孵育的時(shí)間增設(shè)15、60 min兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),以期觀察HA對(duì)心肌細(xì)胞 L-鈣通道α1C、CaM 及Ry R2m RNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。分別在培養(yǎng)板內(nèi)加入Trizol提取細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)A260 nm處測(cè)定吸光度,定量RNA濃度。根據(jù)美國(guó)基因生物庫(kù)的基因核酸序列,選取鳥嘌呤加胞嘧啶(G+C)含量約50%的無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu),相互間無(wú)同源序列兩段特異性保守序列,用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物(北京賽百盛生物技術(shù)公司進(jìn)行合成),引物序列見表1。參照Fermentas公司逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)一步法試劑盒說(shuō)明書操作。取適量PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠,100 V/cm凝膠的電壓下電泳。生物電泳圖像分析儀測(cè)定擴(kuò)增大曲線下的吸光度值,計(jì)算各樣品的L-鈣通道α1C/-actin、CaM/-actin、Ry R2/-actin。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS8.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以±s表示。各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

HA對(duì)心肌細(xì)胞L-鈣通道α1C、CaM及 RyR2 mRNA表達(dá)的影響見圖1及表2、3。

表2 HA對(duì)心肌細(xì)胞L-鈣通道α1C、CaM 及Ry R2 mRNA表達(dá)的影響(15 min)

表 3 HA對(duì)心肌細(xì)胞 L-鈣通道α1C、CaM及 Ry R2 m RNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)影響

圖1 瓊脂糖凝膠電泳

3 討 論

Ca2+是心肌細(xì)胞最重要的第2信使,在維持心臟正常節(jié)律和興奮-收縮偶聯(lián)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-13]。細(xì)胞膜L-鈣通道激活,Ca2+入胞質(zhì)后通過(guò)Ca2+/CaM途徑調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度,激活肌質(zhì)網(wǎng)Ry R2,使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+經(jīng) Ry R2大量進(jìn)入胞質(zhì),引起細(xì)胞收縮[14]。外源性藥物觸發(fā) L-鈣通道、CaM、Ry R2等相關(guān)調(diào)控蛋白的基因改變,將可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào),繼而誘發(fā)嚴(yán)重的藥源性心律失常。作者前期研究證實(shí),HA引起的乳大鼠心肌細(xì)胞快速性心律失常劑量為6～60μΜ/L,導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)停搏的劑量大于或等于60μΜ/L,HA與心肌細(xì)胞共同孵育5～30 min時(shí)細(xì)胞的搏動(dòng)頻率增加最顯著[11]。流式細(xì)胞檢測(cè)HA引起的心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+升高多出現(xiàn)在給藥后15 min,說(shuō)明心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+參與了HA所致的心律失常發(fā)生過(guò)程。

本研究發(fā)現(xiàn),HA能引起心肌細(xì)胞L-鈣通道α1C mRNA高表達(dá),α1C亞基不僅是 L-鈣通道構(gòu)成Ca2+進(jìn)入孔道的主要結(jié)構(gòu),也是細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高時(shí)Ca2+-CaM復(fù)合物反饋性調(diào)節(jié)L-鈣通道的位點(diǎn)[15]。α1C mRNA的高水平表達(dá)表明在HA作用下,L-鈣通道正處于高度開放狀態(tài),亦提示細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+正處于較高濃度。Ry R2是細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣釋放入胞質(zhì)的主要通道,正常生理?xiàng)l件下受細(xì)胞內(nèi)Ca2+/CaM調(diào)控,介導(dǎo)心肌興奮-收縮偶聯(lián)及維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)。HA能同時(shí)增強(qiáng)心肌細(xì)胞CaM和Ry R2基因表達(dá)量,表明CaM和Ry R2可能也參與了HA所致的心肌細(xì)胞內(nèi)“鈣超載”過(guò)程。綜合不同劑量(60、30 μΜ/L)、不同作用時(shí)間(5、15、60 min)HA 對(duì)上述mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響,發(fā)現(xiàn) L-鈣通道、CaM 和 Ry R2基因的表達(dá)量增高與心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的升高相伴發(fā)生,進(jìn)一步證實(shí)HA極有可能通過(guò)對(duì)上述鈣調(diào)控基因mRNA表達(dá)的影響而導(dǎo)致心肌細(xì)胞“鈣超載”及后續(xù)心律失常的發(fā)生。

在烏頭堿類天然藥物臨床中毒所致的心律失常中,HA的存在可能是導(dǎo)致其毒性反應(yīng)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。心肌細(xì)胞L-鈣通道、CaM與Ry R2等鈣調(diào)控蛋白可能是中毒性心律失常發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此,在烏頭堿類天然藥物中毒解救中,干預(yù)上述靶點(diǎn),調(diào)節(jié)、恢復(fù)上述基因的正常表達(dá)可達(dá)到解除中毒性心律失常的目的。

[1] 宋東江,陸滿文,李漢青.烏頭堿類化合物毒理學(xué)研究概況[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1989,5(5):272-273.

[2] 周遠(yuǎn)鵬.附子及其主要成分的藥理作用和毒性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1983,18(5):394-400.

[3] 駱梅娟,周至安.附子的毒性及臨床應(yīng)用淺析[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,26(5):512-514.

[4] 陳春燕.常用中藥方劑可引起嚴(yán)重心律失常[J].重慶醫(yī)學(xué),1994,23(6):370.

[5] 王瑞,劉芳,孫毅坤,等.不同附子炮制品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量的HPLC測(cè)定[J].藥物分析雜志,2006,26(10):1361-1363.

[6] 范明威,陳煒璇,卓廉佳,等.腎氣丸“陰中求陽(yáng)”配伍對(duì)方中烏頭堿和次烏頭堿含量的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(5):24-26.

[7] 劉芳,于向紅,李飛,等.HPLC測(cè)定附子及其炮制品中3種雙酯型生物堿的含量[J].中國(guó)中藥雜志,2006,31(14):1160-1162.

[8] 邊寶林,司南,王宏潔,等.附子單煎以及與浙貝母合煎后烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等有毒成分的含量變化研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2006,12(4):9-10.

[9] 李志勇,張碩峰,暢洪昇,等.不同炮制時(shí)間附子飲片雙酯型生物堿含量變化與飲片安全的相關(guān)性研究[J].中國(guó)中藥雜志,2009,34(9):1086-1089.

[10]張碩峰.附子中3種雙酯型生物堿的心臟毒效關(guān)系及甘草苷的干預(yù)作用[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2007.

[11]李志勇,孫建寧,張碩峰.次烏頭堿對(duì)乳大鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞的毒性作用[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2010,24(4):261-265.

[12]楊曉寧,田宗文,黃煥斌,等.新生大鼠心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)[J].解剖學(xué)雜志,2005,28(3):361-362.

[13]丁翔,仝識(shí)非,秦瑤,等.新生大鼠原代心房肌細(xì)胞鈣超載模型的建立[J].重慶醫(yī)學(xué),2010,39(11):1331-1333.

[14]李寧,浦介麟.鈣離子通道基因異常與室性心律失常[J].中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志,2006,20(1):8-10.

[15]Zuhlke RD,Hudmon A,Schulman H,et al.Molecular basis of calmodulin tethering and Ca2+dependent inactivation of L-type Ca2+channels[J].J Biol Chem,2001,276(33):30794-30802.