化瘀瀉濁方對(duì)腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)大鼠TLR4、NF-кB 的影響

潘利敏，王鳳麗，王彥凱，任秀喜，王月華△

(1.河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011;2.石家莊長(zhǎng)城體檢中心，河北 石家莊 050017)

腎間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis TIF)是各種原因所致腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎功能衰竭的共同病理特征。減輕腎間質(zhì)纖維化的程度能顯著延緩慢性腎臟病向終末期腎病的進(jìn)展速度[1]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)是 TLRs家族中的一員，Toll受體的研究首先是從果蠅開始的，其廣泛分布于各種組織，在識(shí)別感染后通過外源性配體啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫，亦在非感染性炎癥疾病中有著重要的作用。TLR4介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)傳遞涉及不同通路，但最終都要激活核因子-кB(nuelear factork kappa B，NF-кB)。近年來關(guān)于 NF-кB的實(shí)驗(yàn)表明，它們是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的核心因子，既然 TLR4 可以激活 NF-кB[2、3]，我們推測(cè)其在 TIF中可能發(fā)揮了重要的作用。因此對(duì)TLR4、NF-кB的深入研究，必將有助于我們對(duì)腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制的理解，為探索新的治療途徑和開發(fā)臨床新藥提供理論依據(jù)。

化瘀泄?jié)岱绞俏覀冊(cè)谂R床上用于治療慢性腎衰的常用方，有較好的臨床療效，在前期實(shí)驗(yàn)中我們已探討了其部分作用機(jī)制[4、5]。本實(shí)驗(yàn)繼以化瘀泄?jié)岱綄?duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction UUO)誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型進(jìn)行干預(yù)性治療，通過觀察化瘀泄?jié)岱綄?duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物梗阻側(cè)腎臟病理形態(tài)學(xué)、TLR4及NF-кB的影響，探討化瘀泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化的拮抗作用及部分作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康、雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量180g±10g，清潔級(jí)，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)冀醫(yī)動(dòng)管字第703058號(hào)。

1.1.2 主要試劑 兔抗大鼠 TLR4、NF-κB多克隆抗體由Santa Curz公司提供。免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)試劑盒由北京中杉生物工程公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用藥 化瘀泄?jié)岱接缮S芪30g、生大黃 12g、地龍 12g、丹參 15g、蒲公英 15g、槐花 15g、生牡蠣30g、赤芍15 g等組成，由河北省中醫(yī)院藥房提供，上藥按比例稱取后，水煎、過濾、濃縮，裝入瓶中密封備用。纈沙坦由諾華公司提供，批號(hào)X0538。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型和分組 動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、纈沙坦組、化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組，每組10只。纈沙坦組給予纈沙坦5.3mg/(kg·d)經(jīng)口灌服，化瘀泄?jié)岱浇M給予化瘀泄?jié)岱?.7g/(kg·d)經(jīng)口灌服，阿魏酸哌嗪分散片組給予阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d)經(jīng)口灌服，假手術(shù)組和模型組給予同等量生理鹽水經(jīng)口灌服。手術(shù)前1 d開始給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d。左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)參照文獻(xiàn)進(jìn)行。除假手術(shù)組外其余各組均行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。于實(shí)驗(yàn)第21天全部殺檢，取左側(cè)腎臟以4%多聚甲醛固定、包埋、切片，行HE及Masson染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，并采用免疫組化方法檢測(cè)TLR4、NF-кB的表達(dá)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法 SABC法。半定量分析采用HPIAS-1000型全自動(dòng)彩色病理圖像分析系統(tǒng)，在200倍光鏡下采集圖像，每例各選15個(gè)視野，在光亮度和放大倍數(shù)一致的條件下對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量，最后取平均值，TLR4的結(jié)果分析是相對(duì)陽性面積=陽性染色面積/視野大小×100%，NF-кB的結(jié)果分析是計(jì)算1個(gè)視野場(chǎng)中強(qiáng)陽性著色核占腎小管細(xì)胞核總數(shù)的百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-Way ANOVA，組間兩兩顯著性比較采用 LSD法，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE及Masson染色結(jié)果

腎組織HE及Masson染色顯示，模型組腎間質(zhì)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生，腎小管部分萎縮、管腔閉塞或擴(kuò)張，腎小球數(shù)目明顯減少，面積縮小。腎小囊黏連或擴(kuò)張，小囊周圍大量纖維組織增生。其他各治療組間質(zhì)可見多少不等的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，少量纖維組織增生，腎小管輕度擴(kuò)張，部分腎小球輕度萎縮，小囊擴(kuò)張，腎小球數(shù)量無明顯改變。

2.2 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積半定量分析

表1 各組大鼠纖維化面積及TLR4、NF-кB蛋白表達(dá)半定量分析結(jié)果比較(s)

表1 各組大鼠纖維化面積及TLR4、NF-кB蛋白表達(dá)半定量分析結(jié)果比較(s)

注:與正常組比較:△P<0.01;與模型組比較:□P<0.01;與阿魏酸組比較:*P<0.05，○P<0.01

組別 n 纖維化面積(μm2)TLR4(%)NF-кB(%)假手術(shù)組82.476 63.536 88.376 10 872.41±116.62 0.25±0.09 2.93±0.98模 型 組 8 7830.78±1250.80△ 5.68±1.03△ 17.19±2.00△纈 沙 坦 組 9 4532.72±639.56△□○ 2.51±0.57△□○ 10.24±1.69△□*化 瘀 泄 濁 方 組 9 4660.27±991.14△□○ 2.29±0.88 9.79±1.35△□○阿魏酸哌嗪分散片組 9 5852.09±900.44△□ 3.64±0.86△□ 12.27±2.07△□F值

表1顯示，模型組腎間質(zhì)纖維化程度較重;纈沙坦組、化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組與模型組比較，腎間質(zhì)纖維化面積明顯減少(P<0.05)，提示化瘀泄?jié)岱?、阿魏酸哌嗪分散片及纈沙坦均有拮抗腎間質(zhì)纖維化的作用。其中，化瘀泄?jié)岱浇M優(yōu)于阿魏酸哌嗪分散片組(P<0.05)，其他各組間均無明顯差異(P>0.05)。

2.3 TLR4蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析

表1顯示，TLR4主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中，假手術(shù)組TLR4在腎小管上皮細(xì)胞中幾乎無表達(dá)。與假手術(shù)組比較，其余各組在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)顯著增強(qiáng)，間質(zhì)細(xì)胞、腎小球內(nèi)亦有微弱表達(dá)。半定量分析顯示，模型組及各治療組較假手術(shù)組TLR4的表達(dá)呈顯著性升高(P<0.01);纈沙坦組、化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組與模型組相比，TLR4的表達(dá)均呈顯著性下降(P<0.05)。其中化瘀泄?jié)岱浇M優(yōu)于阿魏酸哌嗪分散片組(P<0.05)，其他各組間均無明顯差異(P>0.05)。

2.4 NF-кB蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析

表1顯示，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞核中。半定量分析顯示，模型組及各治療組較假手術(shù)組NF-кB的表達(dá)呈顯著性升高(P<0.01);纈沙坦組、化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組與模型組相比，NF-кB的表達(dá)均呈顯著性下降(P<0.05)，其中，化瘀泄?jié)岱浇M優(yōu)于阿魏酸哌嗪分散片組(P<0.05)，其他各組間均無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 化瘀泄?jié)岱降挠盟幰罁?jù)

各種慢性腎臟疾病遷延不愈，最終均導(dǎo)致慢性腎衰竭，腎間質(zhì)纖維化是慢性腎衰竭的主要病理特征，本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎方法為研究腎間質(zhì)纖維化的典型模型。本病屬于中醫(yī)的“淋證”、“腰痛”、“癃閉”、“關(guān)格”等范疇，其病因病機(jī)有以下幾個(gè)方面。一是先天異常。腎為先天之本，稟賦于父母之精氣，若先天不足，腎精虧虛則尿管及腎發(fā)育異常;二是濕熱蘊(yùn)結(jié)。外邪入侵，郁而化熱，蘊(yùn)結(jié)于腎與膀胱;或內(nèi)熱下移，濕熱互結(jié)，膀胱氣化不利，水液內(nèi)停;三是瘀血絡(luò)阻。久病多瘀、血不利則病水，瘀血阻滯，尿路不暢，水濕郁結(jié)于內(nèi);或瘀血內(nèi)阻，氣滯血瘀，阻塞尿路。總之，本病是以濕熱、瘀血、絡(luò)阻等為基本病機(jī)，且相互轉(zhuǎn)化、相互影響。本實(shí)驗(yàn)以化瘀泄?jié)嶂兴帉?duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化大鼠模型進(jìn)行干預(yù)性治療，符合上述病機(jī)具有可行性。方中丹參、赤芍、大黃、地龍活血通絡(luò)，化瘀泄?jié)?蒲公英、槐花清熱利濕，解毒泄?jié)?加用生牡蠣軟堅(jiān)散結(jié);生黃芪益氣，且黃芪益氣有走而不守之性，所以本品益氣不僅可以扶正固本，又可以助丹參、地龍等行血消瘀通絡(luò)祛邪治標(biāo)。諸藥相伍通補(bǔ)并用、標(biāo)本兼顧，故成為我們臨床用于延緩腎臟病發(fā)展進(jìn)程的基礎(chǔ)方。

3.2 化瘀泄?jié)岱降淖饔脵C(jī)理探討

腎小管間質(zhì)纖維化(renal tubulointerstitial fiborsis)是多種慢性腎臟疾病如慢性腎炎、慢性腎盂腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等發(fā)展到終末期腎衰的共同途徑。它以過量細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為特征。TLR4是介導(dǎo)內(nèi)毒素脂多糖(LPS)反應(yīng)的細(xì)胞表面特異性受體。LPS與其受體 TLR4結(jié)合，最終都要激活 NF-кB或MAPK。NF-кB是誘導(dǎo)前炎癥因子表達(dá)的中樞調(diào)節(jié)器，在腎臟的腎小球細(xì)胞、腎小球上皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中廣泛存在，TLR的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大作用使IкB磷酸化降解，NF-кB得以激活并移位進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA分子上炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)基因中啟動(dòng)子區(qū)域的NF-кB結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞因子(如 IL-l、IL-6、IL-8、IL-12、INF-a、MIP、VCAM-1、ELAM-1 以及組織因子、黏附分子及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶等)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，最終導(dǎo)致炎癥因子大量釋放。一些被NF-кB激活的因子又會(huì)反過來進(jìn)一步誘導(dǎo)NF-кB的激活，在生物體內(nèi)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)。大量體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，在多種腎臟疾病中，存在NF-κB的表達(dá)和活化，抑制 NF-κB活性可改善腎臟炎癥和腎間質(zhì)纖維化。我們的研究發(fā)現(xiàn)，TLR4、NF-κB在梗阻性腎病導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)是升高的，說明TLR4在腎間質(zhì)纖維化疾病中可以通過激活NF-κB參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展，進(jìn)而我們認(rèn)為化瘀泄?jié)岱侥芡ㄟ^抑制腎組織TLR4、NF-кB蛋白的表達(dá)，從而減輕腎臟病理損害，減少纖維化面積，延緩病變腎組織纖維化進(jìn)程。

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[4]潘利敏，王彥凱，王月華，等.化瘀泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)大鼠增殖細(xì)胞核抗原的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15(11):832-833.

[5]潘利敏，王彥凱，王月華，等.化瘀泄?jié)岱綄?duì)腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15(9):668-669，672.