青蒿素的免疫抑制作用及其調控機制研究

李 覃，陳 虹，梅 昕，那春祺，韋 娜，曹 波，白淑芳

(1.天津武警醫(yī)學院免疫學教研室，2.天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標志物重點實驗室，3.天津武警醫(yī)學院生藥學教研室，天津 300162)

近年來，隨著工業(yè)化程度的逐步提高，自身免疫性疾病、超敏反應性疾病等由免疫反應過度而引起的疾病也在不斷增加，尋找高效低毒的免疫抑制劑已成為當前一個研究熱點。有證據(jù)表明，中藥免疫抑制劑具有高效低毒的特殊療效，但由于制劑質量難以控制、作用機制難以明確，限制了其在臨床中的廣泛應用。采用現(xiàn)代提取分離技術，從中藥中獲得具有免疫抑制活性的單體化合物，將克服這些不足，并有望創(chuàng)制免疫抑制新藥。青蒿為菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL的干燥地上部分，主要含有青蒿素、青蒿甲素、青蒿丙素、青蒿酸、青蒿內(nèi)酯、黃酮、香豆素和揮發(fā)油等成分，具有清熱解暑、除蒸、截瘧等功效［1］。其中，化學單體青蒿素(artemisinin，Art)由我國藥學家首先于20世紀70年代提取分離得到，分子式C15H22O5(Fig 1)，是我國第一個被WHO認可按西藥研究標準開發(fā)的高效抗瘧藥。由于腦型瘧疾的發(fā)病機制與自身免疫有關，因此人們推測Art除直接殺滅瘧原蟲外，還可能具有免疫調節(jié)作用。通過近十年的實驗及臨床研究證實，青蒿素具有一定的免疫抑制活性，對類風濕性關節(jié)炎、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病都顯示出不同程度的治療或保護作用［2］，但具體作用機制尚未完全闡明。本文通過體外細胞培養(yǎng)和體內(nèi)動物實驗，進一步探討青蒿素調節(jié)機體免疫系統(tǒng)及其免疫抑制的作用機制。

Fig 1 Chemical structure of artemisinin

1 材料與方法

1.1主要材料Art(純度99.5%)購于鄭州荔諾生物科技發(fā)展有限公司;DMSO、MTT、二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)、ConA、地塞米松(dexamethasone，Dex，純度≥ 98%)購于 Sigma 公司;RPMI 1640、胎牛血清(FCS)購于 Gibco公司;p38 MAPK及其磷酸化抗體Phospho-p38 MAPK(Thy180/Tyr182)購于Santa Cruz公司，WST-1細胞增殖試劑盒、p-38MAPK抑制劑SB203580購于碧云天公司;Bradford蛋白濃度測定試劑盒、增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購于Pierce公司;TGF-β1 ELISA試劑盒購于R＆D公司;ICR小鼠(6～8周齡，♀)購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，動物合格證SCXK-(軍)2007-004。

1.2細胞懸液的制備小鼠眼球取血處死，無菌分離小鼠頸部、頜下、鎖骨下、腋窩等處淋巴結，200目篩網(wǎng)研磨過濾，收集細胞懸液，洗滌3次(4℃，250×g，5 min)，以RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%熱滅活FCS，100 ku·L－1青霉素 － 鏈霉素)調細胞密度為1 ×109·L－1。

1.3細胞培養(yǎng)及增殖活性分析Art溶于DMSO成1 mmol·L－1，濾過除菌，－20℃貯存，體外實驗時以RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度(DMSO終濃度不高于0.1%，該濃度對細胞生長無明顯影響)。檢測ConA刺激的T淋巴細胞增殖。實驗分組如下:空白本底(只加RPMI 1640完全培養(yǎng)基)、對照組(5 mg·L－1Con A)和不同濃度Art干預下的ConA實驗組，培養(yǎng)48 h。按照WST-1細胞增殖試劑盒說明，每孔加20 μl WST-1溶液，450 nm處測定光吸收度(A值)，計算細胞生長抑制率。抑制率/%=(對照組A均值－實驗組A均值)/(對照組A均值－空白本底A均值)×100%。以地塞米松(Dex)作為陽性對照藥物。同時，另設DMSO溶劑對照組，觀察其對細胞增殖活性的影響。

1.4MTT法檢測藥物毒性參照文獻，以MTT法檢測藥物的毒性作用［3］。將已制備好的單細胞懸液接種于96孔板，設空白本底、對照組(只加淋巴細胞懸液)、實驗組(加入相應濃度的藥物)。48 h后，加入5 g·L－1MTT 20 μl，37C 避光孵育4 h，250×g離心5 min，棄上清，加入100 μl/孔 DMSO 溶解甲臜結晶，于490 nm波長檢測各孔A值，計算各組細胞的相對存活率。相對存活率/%=［(A實驗組－A空白本底)/(A對照組－A空白本底)］×100% 。同時，另設DMSO溶劑對照組觀察其對細胞生長狀態(tài)的影響。1.5動物模型的建立及給藥方法以典型的細胞免疫反應——遲發(fā)型超敏反應(delayed-type hypersensitivity，DTH)為指標，體內(nèi)給藥探討 Art的免疫調節(jié)功能。參照文獻方法［4］建立DTH小鼠模型:實驗前1 d小鼠腹部去毛約3 cm。開始日(d 0)和d 1于去毛部位涂0.5%DNFB(以4∶1丙酮橄欖油配制)40 μl致敏。d 6于左耳內(nèi)外側涂0.3%DNFB 20 μl激發(fā)。誘發(fā)前0.5 h和誘發(fā)后6 h小鼠左耳外涂Art乳膏(本室自制，Art濃度分別為2%、4%、8%)。激發(fā)后48 h處死小鼠。以Dex作為陽性對照。以乳膏基質作為基質對照。同時另設正常小鼠對照組，以相應劑量Art處理，觀察正常機體對Art是否有毒副反應。

1.6DTH反應的測定頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器在相同部位取直徑8 mm耳片，游標卡尺測厚度、電子天平稱重量;同時取小鼠胸腺及脾臟稱重。以左右耳片厚度、重量之差為腫脹度;以每10g小鼠的脾重和胸腺重作為脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。胸腺(脾)指數(shù)=［胸腺(脾)質量(mg)/體質量(g)］×10。

1.7RT-RCR法檢測T-bet、GATA-3的mRNA表達收集各組小鼠引流淋巴結，采用異硫氰酸胍法提取組織RNA，分光光度計測 A260/A280比值在1.8～2.0之間。引物序列由金思特科技有限公司合成如下:T-bet(413 bp):上游引物5'-GATCGTCCTGCAGTCTCTCC-3'，下游引物 5'-AACTGTGTTCCCGAGGTGTC-3';GATA-3(364 bp):上游引物5'-AGTGTGTGAACTGCGGGGCA-3'，下游引物 5'-TCCAGCGCGTCATGCACCTT-3';GAPDH(225 bp):上游引物5'-TGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游引物5'-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3'。按照 Promega公司逆轉錄試劑盒說明進行cDNA合成。PCR擴增條件為:預變性94℃ 5 min，94℃ 30 s、57℃ 45 s、72℃ 30 s，共34個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，應用Gel-Doc2000凝膠成像分析系統(tǒng)測定各組條帶。

1.8雙抗體夾心ELISA法檢測TGF-β1含量收集各組小鼠耳片組織，置于含0.1%Tween 20的PBS中勻漿，取上清，雙抗體夾心 ELISA法檢測TGF-β1含量。將抗小鼠TGF-β1單抗包被于酶標板，標準品和樣品中的TGF-β1與單抗結合形成免疫復合物，加入生物素化的抗小鼠TGF-β1抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素、生物素與親和素結合，加酶底物顯色，用MK3酶標儀在450nm處測定A值，通過繪制標準曲線求出標本中TGF-β1含量。

1.9Western blot檢測p38 MAPK的活性表達收集各組小鼠淋巴結，提取組織蛋白，Bradford法定量蛋白含量，SDS-PAGE電泳，半干法轉至 PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(phospho-p38 MAPK，1∶1 000)孵育，4℃過夜，TBST洗膜后以辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL法檢測。用Stripping Solution洗脫、封閉后，再次加入一抗(p38 MAPK，1∶1 000)、二抗，顯影。采用BioRad系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析處理。此外，另建DTH模型，給予p-38MAPK的選擇性抑制劑SB203580(0.2%)進行干預，給藥方式同前，觀察小鼠耳腫脹情況。

1.10統(tǒng)計學方法計量資料以±s表示，所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析進行組間比較。

2 結果

2.1Art對小鼠T淋巴細胞增殖的影響如Fig 2所示，各劑量Art對ConA誘導的T細胞增殖呈現(xiàn)明顯的抑制作用，與低劑量 3.13 μmol·L－1相比，25～200 μmol·L－1抑制率差異有顯著性。達到 200 μmol·L－1時，Art的抑制效應甚至高于Dex陽性對照組。

Fig 2 Artemisinin inhibited ConA-induced lymphocyte proliferation

2.2Art的細胞毒性作用3.13 ～200 μmol·L－1的Art作用48 h后，細胞存活率都在70%以上(Fig 3)，毒性低于最高的毒性致死量(一般指50%致死所需的藥物劑量)，因此可認為該藥物毒性較小。陽性對照Dex的毒性作用明顯高于Art(P＜0.01)，最低存活率僅(38.97±3.18)%。此外，實驗條件下DMSO溶劑對細胞生長增殖和活性狀態(tài)均未見明顯影響。

Fig 3 The cytotoxicity of artemisinin

2.3Art抑制DTH小鼠耳腫脹度與DTH模型小鼠相比(Fig 4)，透皮給藥的各劑量Art均明顯抑制小鼠耳腫脹，且呈一定的劑量依賴性。Art對DTH的抑制效應提示其能有效下調機體的細胞免疫應答。此外，乳膏基質對照組對小鼠未見明顯影響，說明基質對DTH沒有作用(數(shù)據(jù)未顯示)。

Fig 4 Artemisinin suppressed the DTH in mice

2.4Art對脾/胸腺指數(shù)的影響DTH模型組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均明顯升高，Art干預組可降低免疫器官的臟器指數(shù)，差異具有顯著性(Fig 5)。因此，實驗條件下Art顯示出一定的免疫抑制效應。與初始體重相比，各劑量Art對小鼠體質量均無明顯影響，而Dex則明顯降低小鼠體質量，占初始體質量的(97.61±2.85)%，顯示出一定的機體毒性。此外，接受相應劑量Art的正常小鼠未見有何不良反應，說明實驗條件下Art對正常機體無明顯毒副作用。

2.5Art對Th1/Th2細胞轉錄因子基因表達的影響T-bet選擇性表達于Th1細胞，是Th1細胞特異性轉錄因子，在Th1細胞的分化過程中起決定性作用［5］;GATA-3 則是 Th2 細胞的特異性轉錄因子［6］。為探討Art對Th1/Th2免疫平衡的調節(jié)作用，采用RT-PCR檢測T-bet和GATA-3的基因表達。結果顯示(Fig 6)，Art能夠抑制T-bet基因表達，同時上調GATA-3的mRNA水平，最終使T-bet/GATA-3比值明顯降低?？梢姡珹rt通過影響T-bet和GATA-3基因表達抑制Th1細胞分化、促進Th2細胞分化，從而調節(jié)Th1和Th2免疫應答的平衡。

Fig 5 Effect of artemisinin on body weight and immune organ index

Fig 6 Effect of artemisinin on the T-bet and GATA-3 expression

2.6Art上調TGF-β1與對照組相比，Art能夠劑量依賴的增加DTH小鼠耳組織TGF-β1含量，提示通過調節(jié)TGF-β1水平發(fā)揮免疫抑制效應是其作用機制之一(Fig 7)。

Fig 7 Effect of artemisinin on the production of TFG-β1

2.7Art抑制Phospho-p38 MAPK的活性表達水平Western blot結果顯示(Fig 8)，DTH模型組Phospho-p38 MAPK蛋白表達較正常組明顯升高，Art干預組均能抑制p38 MAPK蛋白的磷酸化活性表達，同時非磷酸化p38 MAPK表達無明顯變化。DTH小鼠耳部外用p-38MAPK選擇性抑制劑SB203580后，耳腫脹明顯抑制，與模型對照組相比差異具有顯著性，而與Dex陽性對照組無差別，提示p38 MAPK通路或許是Art抑制DTH的的重要途徑之一。

Fig 8 Inhibitory effect of artemisinin on phosphorylated-p38 MAPK expression

3 討論

傳統(tǒng)的免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、糖皮質激素等在器官移植和自身免疫性疾病等方面發(fā)揮著重要作用，但這些藥物具有選擇性不強，毒副作用大等缺點，限制了其在臨床上的廣泛應用。而中藥免疫抑制劑具有藥理作用廣泛、毒副作用小、無依賴性等特點，故從天然藥物中尋找提取高效低毒的免疫抑制劑已成為制藥界的熱點。Art是一種天然植物提取物，已被廣泛用于治療瘧疾。此外，它還具有抗腫瘤、抗病毒、抗寄生蟲等多方面的藥理學作用［7］。近年來，國內(nèi)外研究表明，Art及其衍生物對免疫系統(tǒng)有著較為復雜的影響，不同條件下能夠表現(xiàn)出雙向免疫調節(jié)作用。例如Yang等［8］報道，Art能增強正常小鼠T細胞介導的免疫應答，對免疫功能的重建具有一定作用;而中國科學院上海藥物研究所的系列研究顯示:蒿甲醚［9］等青蒿素類衍生物具有廣泛的免疫抑制效應，包括抑制T細胞增殖分裂、阻止促炎因子及炎癥介質的釋放、抑制B細胞增殖和抗體分泌等。新近研究顯示［10］，Art的免疫抑制作用甚至強于環(huán)孢素A，可用于自身免疫性疾病的治療，因此對該類藥物的研究也越來越受到重視。

本研究首先通過體外細胞培養(yǎng)證明，Art對ConA誘導的小鼠T細胞增殖具有明顯的抑制作用，高劑量時其抑制效應甚至高于Dex，而且毒性更低。體內(nèi)研究采用的動物接觸性超敏反應為皮膚接觸致敏原引起的一種特殊DTH，大多在致敏原激發(fā)后24～48 h到達高峰，是由特異性致敏T淋巴細胞介導的細胞免疫反應［11］。免疫器官(胸腺、脾)不僅是淋巴細胞分化成熟的場所，也是產(chǎn)生特異性免疫應答的場所，其重量降低或升高程度反映了機體的免疫功能狀態(tài)。本研究結果表明，Art明顯降低DTH模型小鼠免疫器官的臟器指數(shù)，減輕耳腫脹度，提示其通過下調機體細胞免疫應答發(fā)揮免疫抑制作用，而且較Dex顯示出更為優(yōu)越的安全性。

目前認為，Th1細胞是參與DTH的重要細胞之一，通過分泌干擾素-γ(IFN-γ)等細胞因子介導細胞免疫;Th2細胞則分泌白介素-4(IL-4)等細胞因子介導體液免疫。Th1和Th2互為抑制細胞，導致DTH中Th1/Th2免疫失衡。國內(nèi)外已有大量研究通過細胞因子水平干預治療來糾正Th1/Th2的免疫失衡，包括用Th2因子基因封閉和Th1因子基因轉染，但療效并不滿意。T-bet為Th1細胞轉錄因子，是反映Th1釋放細胞因子的特異性標志。GATA-3選擇性表達于Th2細胞，是目前確定的唯一能調控Th2型細胞因子合成的特異性轉錄因子。研究表明，T-bet可以抑制GATA-3表達并誘導已分化成熟的 Th2 向 Th1 逆向轉化［12－13］，而 GATA-3 在促進Th2發(fā)育的同時也能抑制T-bet，因此，調控T-bet/GATA-3基因表達可以從Th1/Th2細胞分化的上游控制Th1/Th2平衡，克服單一細胞因子作用的片面性。本研究結果顯示，Art不僅明顯抑制T-bet基因表達，而且能夠促進 GATA-3的表達，從而影響Th1/Th2細胞分化。

TGF-β是細胞生長、分化的重要調控因子，可由活化的 T細胞產(chǎn)生，有 β1、β2、β3三種亞型，其中TGF-β1所占比例最高(＞90%)，活性最強，能抑制淋巴細胞增生及轉化，誘導免疫活性細胞凋亡［14］。新近研究發(fā)現(xiàn)［15］，體內(nèi)存在一類具有免疫無能和免疫抑制兩大特性的細胞，稱為調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)，其中誘導性Treg中的Th3細胞主要通過產(chǎn)生TGF-β抑制Th1和Th2細胞增殖和功能，從而發(fā)揮免疫抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Art能夠劑量依賴的促進 TGF-β1產(chǎn)生，提示其通過上調TGF-β1水平，抑制DTH小鼠的炎癥反應，并且還能在抗過敏方面發(fā)揮重要作用。但Art對TGF-β的影響是否與其促進Th3有關尚需進一步研究闡明。

DNFB誘導的DTH是由T細胞介導的、在多種細胞因子參與下的皮膚炎癥反應，而炎癥過程中的信號轉導系統(tǒng)及相互關系錯綜復雜，現(xiàn)已初步證明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路在其中發(fā)揮著重要作用。哺乳動物細胞中MAPKs主要由3個成員構成，即細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)。其中p38 MAPK作為信號轉導通路的交匯點在炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［16］。本研究顯示，Art明顯減弱p38 MAPK的磷酸化活性表達，其對DTH的抑制效應與p-38MAPK選擇性抑制劑SB203580相近。需要指出的是，作為p38 MAPK信號途徑中重要的上游介質，TGF-β1亦可通過MKK介導激活p38 MAPK，繼而通過對下游多種靶基因的轉錄調控，參與細胞凋亡、轉分化等過程。因此，Art對TGF-β1與p38 MAPK之間的這種雙向調控作用的具體機制還需進一步研究闡明。

總之，本研究中，Art能夠明顯抑制ConA誘導的T細胞增殖及DTH反應;影響Th1/Th2免疫失衡，促使Th1型免疫應答向Th2型轉變;促進抑制性因子TGF-β1產(chǎn)生以及下調p38 MAPK信號。因此，通過對其獨特的作用機制進行更深入的研究，將有利于青蒿素類藥物更廣泛的用于臨床，并為將其開發(fā)成新型免疫抑制藥物提供實驗依據(jù)。

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