肝動脈栓塞化療聯(lián)合恩度治療對兔VX2肝移植瘤生長及血管生成的影響

謝 斌，位曉丹，高志芹，吳 潼，石劍飛，蹇兆成，孫業(yè)全，王 濱

(濰坊醫(yī)學(xué)院1.細(xì)胞生物學(xué)教研室，2.附屬醫(yī)院影像中心，山東濰坊 261053)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種富血供的惡性實體瘤，嚴(yán)重威脅人們的健康。肝動脈栓塞化療(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)自1976年Goldstain等首先報道后得到廣泛應(yīng)用，現(xiàn)已成為治療手術(shù)不能切除肝癌的首選療法［1-2］，但其5年的生存率低于10%。通過研究發(fā)現(xiàn)［3］，TACE治療后由于殘癌組織內(nèi)缺氧，致VEGF等表達(dá)升高，促進(jìn)新生血管的生成，為腫瘤生長提供營養(yǎng)及氧氣，促進(jìn)其增殖、轉(zhuǎn)移。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為抗血管生成治療對腫瘤只能抑制其生長，并不能治愈，需其他療法的聯(lián)合應(yīng)用。因此若將TACE與抗血管生成聯(lián)合應(yīng)用，在阻斷肝動脈供血的同時抑制血管生成，將為肝癌治療提供一條新途徑。有研究表明恩度肝動脈灌注聯(lián)合介入栓塞化療治療肝癌，近期效果滿意［4］。但目前相關(guān)報道較少，療效尚需大量的實驗證實。故本實驗將TACE和恩度聯(lián)合應(yīng)用治療兔VX2肝移植瘤模型，通過評價相關(guān)性指標(biāo)，探討其治療機(jī)制，為其聯(lián)合應(yīng)用可行性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康新西蘭純種大白兔24只，♂性，3 月齡，(2.32 ±0.47)kg，由山東省農(nóng)科院提供(許可證號:sxk-魯-2004-0013);瘤兔1只由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供(許可證號:scxk-京-2005-0002)。

1.2實驗試劑阿霉素購自浙江海正公司;超液化碘油購自法國Guerbet公司;恩度購于煙臺麥得津;鼠抗人CD31單抗、Envision檢測試劑盒購于丹麥Dako公司、鼠抗 VEGF 單抗、PCNA、β-actin、PV-9000通用試劑盒等均購自北京中杉金橋;NC膜、BCA蛋白測定試劑盒、ECL顯色試劑盒購自碧云天。

1.3試驗方法

1.3.1建立模型、實驗分組和藥物干預(yù)參照文獻(xiàn)報道方法并加以改進(jìn)建立兔VX2肝移植瘤模型［5］，用二維超聲檢測瘤體至0.5～1.5 cm3時(接種 d 13)，將24只瘤兔隨機(jī)分為TACE組(經(jīng)微導(dǎo)管肝動脈灌注充分混勻的0.2 ml·kg-1超液態(tài)碘油與2 mg·kg-1阿霉素混合液)、抗血管生成組(經(jīng)微導(dǎo)管肝動脈灌注 2 ml·kg-1恩度、0.2 ml·kg-1超液態(tài)碘油與2 mg·kg-1阿霉素的混合液)和對照組(經(jīng)微導(dǎo)管肝動脈灌注同等劑量的生理鹽水10 ml·kg-1)，每組8只，術(shù)后3 d，實驗兔肌肉注射青霉素40萬單位，連用4 d，預(yù)防感染。

Tab 1 Tumor volume in different phases of each group(±s，n=8)

Tab 1 Tumor volume in different phases of each group(±s，n=8)

*P ＜0.05 vs control group

Group Tumor volum/cm3 Preoperative 7 d after operation 14 d after operation VGR/%7 d after operation 14 d after operation TACE 1.245 ±0.411 3.172 ±2.277 9.871 ±4.470* 203.9 ±255.8 741.9 ±390.3*Anti-angiogenesis 1.193 ±0.324 3.082 ±1.139 8.800 ±5.577* 152.1 ±27.1* 545.3 ±274.9*Control 1.147 ±0.564 4.439 ±2.956 15.873 ±3.321 249.4 ±86.4 1501.3 ±533.4

1.3.2影像學(xué)檢查用超聲實時監(jiān)測腫瘤大小、腫瘤內(nèi)部及周邊的回聲、有無壞死等。測量腫瘤的長徑和短徑，計算腫瘤體積V=0.5×a×b2及體積生長率VGR(%)=(V2-V1)/V1。

1.3.3標(biāo)本制備及免疫組化檢測TACE術(shù)后14 d，空氣栓塞處死全部實驗動物，部分新鮮腫瘤組織(主要采用邊緣組織)用Western blot法檢測VEGF的表達(dá)。剩下組織4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，抗CD31單抗(工作濃度1∶50)按Envision法免疫組化檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行，每批染色均設(shè)立陽性及陰性對照，試劑盒中已知陽性表達(dá)組織作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照;抗PCNA單抗(工作濃度1∶50)按通用型二步法試劑盒說明書步驟進(jìn)行。MVD計數(shù)參照Weidner［6］方法進(jìn)行，先在40倍顯微鏡下掃視整個切片，尋找血管密度區(qū)，即“熱點”，再在200倍鏡下計數(shù)染成棕黃色的血管數(shù)結(jié)果，用5個200倍視野下血管數(shù)目的平均數(shù)表示。PCNA陽性細(xì)胞染色為胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，在400倍視野下隨機(jī)選取5個視野的200個細(xì)胞，按公式計算PCNA陽性細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)=PCNA陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞數(shù)。1.3.4Western blot檢測取50 mg組織，加蛋白裂解液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，煮沸變性。10%的SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，30 mA恒流、4℃轉(zhuǎn)移過夜。5%BSA中37℃封閉1 h，加VEGF抗體，β-actin抗體(1∶200)，4℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)，37℃孵育1 h。應(yīng)用ECL顯影、Quanity One軟件分析，計算各樣品VEGF蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.5統(tǒng)計學(xué)處理所得數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，劑量資料用±s表示，包括t檢驗、方差分析、Pearson直線相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1超聲檢測結(jié)果接種2周后，全部實驗兔在超聲下均于肝左葉檢測到孤立結(jié)節(jié)影。治療后7 d，抗血管生成組腫瘤體積生長率與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。治療后14 d，TACE組和抗血管生成組腫瘤體積和腫瘤體積生長率均明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見Tab 1。

2.2兔VX2肝移植瘤模型肝癌組織形態(tài)學(xué)觀察肉眼觀:標(biāo)本為類圓形腫塊，切面灰白色、質(zhì)韌，部分可見小片狀液化性壞死。見Fig 1。

Fig 1 Pathological morphology in-situ observation of rabbit model of transplanted VX2 hepatic tumor

鏡下觀:肝實質(zhì)細(xì)胞部分呈多角形或圓形，有明顯的異型性。胞核大深染，核分裂象多見，核質(zhì)比增大。異型性細(xì)胞呈浸潤性生長，與周圍肝實質(zhì)無明顯分界，其間可見部分異性細(xì)胞排列成巢狀，血竇消失。肝組織間質(zhì)內(nèi)可見部分血管內(nèi)皮增生，結(jié)締組織減少。由此可見造模成功(Fig 2)。

Fig 2 PCNA expressions of rabbit model of transplanted VX2 hepatic tumor after treatment and HE staining

Fig 3 CD31 expressions in rabbit model of transplanted VX2 hepatic tumor tissue(×200).

2.3免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，腫瘤微血管強(qiáng)陽性區(qū)域主要分布在腫瘤壞死區(qū)殘存組織及周邊(Fig 3)?？寡苌山MMVD值明顯低于其余兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見Tab 2。其余兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。PCNA主要為細(xì)胞核陽性定位呈顆粒型，染色呈現(xiàn)棕黃色，見Fig 1，抗血管生成組PI最低，與其余兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見Tab 2。

2.4Western blot檢測采用Western blot檢測結(jié)果顯示，TACE組VEGF蛋白的相對量最高，與另兩組相比差異均具統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，抗血管生成組與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見 Fig 4，Tab 2。

Fig 4 Expression of VEGF，β-actin in rabbit model of transplanted VX2 hepatic tumor tissue.

Tab 2 Expression of PCNA，CD31 and VEGF protein(±s，n=8)

Tab 2 Expression of PCNA，CD31 and VEGF protein(±s，n=8)

*P ＜0.05 vs control group，△P ＜0.05 vs TACE group

Group PI/% MVD VEGF TACE 85.36 ±10.37 53.18 ±7.58 1.29 ±0.11*Anti-angiogenesis 62.83 ±7.82＊△ 31.55 ±6.71＊△ 0.60 ±0.05＊△Control 82.67 ±11.25 56.53 ±10.47 0.85 ±0.06

2.5 MVD、VEGF和VGR之間的相關(guān)性分析相關(guān)性分析結(jié)果顯示，3個實驗組中 MVD計數(shù)與VEGF表達(dá)之間均呈正相關(guān)性(r=0.933，P＜0.05);VEGF表達(dá)與VGR的分布之間也呈正相關(guān)性(r=0.563，P＜0.05)。

3 討論

VEGF的表達(dá)是促進(jìn)腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一。許多研究［7-8］表明，經(jīng)導(dǎo)管動脈內(nèi)栓塞后，VEGF表達(dá)上調(diào)，通過旁/自分泌作用機(jī)制，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)血管新生并直接刺激腫瘤細(xì)胞生長［9］。我們通過前期實驗［10］也得到類似的結(jié)果:TACE栓塞后促進(jìn)了VEGFmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而促進(jìn)了新生血管的形成。如何限制TACE術(shù)后殘癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤血管生成已成為關(guān)鍵性問題。

MVD是腫瘤血管生成的金評價指標(biāo)，1990年Weidner采用內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物顯示乳腺癌新生血管，發(fā)現(xiàn)MVD與腫瘤侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者預(yù)后是相關(guān)的。CD31分子在人體實體腫瘤中主要表達(dá)于一些脈管及相關(guān)來源的腫瘤，如組織細(xì)胞惡性腫瘤、上皮樣的血管內(nèi)皮瘤及肉瘤等，參與腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮之間黏附過程。本實驗利用MVD作為抑制血管生成療效的檢測指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，抗血管生成組MVD較其它兩組明顯降低。而單純TACE組MVD高于抗血管生成組，甚至稍高于對照組，表明TACE阻斷腫瘤血供，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞變性壞死的同時，促使腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。病理研究認(rèn)為，腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等惡性行為隨著MVD的增加而增加?？寡苌山MMVD及VEGF表達(dá)較單純TACE與對照組明顯減低。這充分說明了TACE聯(lián)合抗血管生成治療的必要性。我們通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，3個實驗組中MVD計數(shù)與VEGF表達(dá)之間均呈密切的正相關(guān)性趨勢，許多研究［11-12］也得到一致結(jié)果。說明將VEGF表達(dá)與MVD計數(shù)相結(jié)合對腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷更有意義。

細(xì)胞增殖和凋亡平衡的失調(diào)對細(xì)胞癌變的引發(fā)、癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞的生存及生長起著極其重要的作用，并對評估腫瘤預(yù)后有一定意義［13］。PCNA能較好地反映腫瘤生物學(xué)行為，在腫瘤的良惡性的劃分及惡性程度的確定上有著廣泛的應(yīng)用。PCNA的表達(dá)程度預(yù)示著細(xì)胞增殖活性及組織侵犯特性。本實驗中，抗血管生成組在TACE和恩度聯(lián)合應(yīng)用治療后腫瘤細(xì)胞增殖活性受抑制程度明顯高于其他兩組。

綜上所述:TACE和恩度聯(lián)合使用在下調(diào)VEGF的表達(dá)，降低MVD以及抑制細(xì)胞增殖方面都具有單純TACE所不具備的優(yōu)勢。但目前對TACE和恩度聯(lián)合使用在肝癌治療方面的報道較少，且治療機(jī)制尚未探明，仍需大量工作為其臨床應(yīng)用可行性提供依據(jù)。

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