CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型肝纖維化逆轉(zhuǎn)與MAPK信號(hào)通路的研究

李政通，李 俊，黃 成，李 浩，章圣鵬，黃 艷，陶 輝

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽天然藥物活性研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥三級(jí)實(shí)驗(yàn)室“中藥藥理實(shí)驗(yàn)室”，安徽合肥 230032)

肝纖維化是肝臟對(duì)慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，是持續(xù)性肝損傷的共有病理改變，肝細(xì)胞發(fā)生持續(xù)、反復(fù)的壞死或炎癥刺激，大量纖維增生同時(shí)伴有纖維降解的相對(duì)或絕對(duì)不足，ECM在肝內(nèi)大量沉積并最終演變?yōu)楦斡不?－3］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)［4－5］，肝纖維化有逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的可能，在人或動(dòng)物模型均有報(bào)道。CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型是一個(gè)經(jīng)典模型，在肝纖維化模型成功后，停止用CCl4誘導(dǎo)，大鼠肝纖維化也有類似的逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期，然而其逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的機(jī)制尚不清楚［6－7］。MAPK信號(hào)通路是真核細(xì)胞調(diào)控介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要系統(tǒng)，主要包括ERK/MAPK、JNK/MAPK、p38/MAPK三條信號(hào)通路，其在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中亦有重要作用［8］。然而，MAPK信號(hào)通路在肝纖維化逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的作用目前研究較少。為此，本實(shí)驗(yàn)采用CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，研究其逆轉(zhuǎn)過(guò)程肝纖維化大鼠肝臟中MAPK通路蛋白表達(dá)變化，以期了解MAPK信號(hào)通路與肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Sprague-Dawely(SD)大鼠，♂，體質(zhì)量200～250 g。與安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào))。

1.2主要藥品與試劑CCl4(AR級(jí)，汕頭西隴化工廠);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒、羥脯氨酸(Hyp)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原氨端肽(PⅢNP)放免試劑盒均購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所;兔抗ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體:Santa Cruz產(chǎn)品;鼠抗 JNK1/2、p-JNK1/2、p38、pp38多克隆抗體:Cell Signaling產(chǎn)品。

2 方法

2.1動(dòng)物模型的建立與處理SD大鼠90只，隨機(jī)分為正常組(n=40)和肝纖維化逆轉(zhuǎn)模型組(n=50)。模型組大鼠皮下注射50%CCl4(CCl4∶花生油=1 ∶1，1 ml·g－1)，正常組以同樣方法注射等量花生油作對(duì)照，每周二、周五注射，一周兩次，共12周。模型組于造模結(jié)束后第 0、2、4、6、8周分批處死動(dòng)物，每次8只，同時(shí)處死8只正常大鼠作為對(duì)照。大鼠取血后室溫靜置 1 h，3 000 r·min－1離心15 min，分離血清。按試劑盒操作賴氏法檢測(cè)ALT、AST，ELISA法檢測(cè)LN、PⅢNP，放免法測(cè)肝組織中 Hyp含量。Masson染色觀察肝組織中膠原沉積。病理組織觀察經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.10的甲醛固定的組織，石蠟包埋，做常規(guī)組織切片，Masson膠原染色，100倍光鏡下觀察并比較各組織的病理狀況，并對(duì)Masson染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。肝纖維化程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為［9］:0:無(wú)纖維化;1:輕度纖維化，纖維沉積僅位于小葉中央;2:中度纖維化，纖維沉積擴(kuò)展至小葉中央之外，但未至小葉邊緣;3:嚴(yán)重肝纖維化，纖維沉積擴(kuò)展至小葉邊緣;4:早期肝硬化(定性標(biāo)準(zhǔn))。肝組織迅速冷凍保存。

2.2Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)取正常組、模型組、恢復(fù)2、4、6、8周各組肝組織分別約100～150 mg。用RIPA蛋白裂解液(主要成分為1%TritonX-100，1%Noidet P-40，0.5%sodium deoxycholate，1 mmol·L－1PMSF和蛋白酶抑制劑復(fù)合物)裂解進(jìn)行勻漿、裂解，12 000 r·min－1離心后取上清(蛋白)分裝于0.5 ml離心管中，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取總蛋白5 μg進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)移。第一抗體在4℃中孵育過(guò)夜，再與HRP偶聯(lián)第二抗體室溫中孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色，X線片放射自顯影壓片。按照以上步驟，分別檢測(cè) p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38和 p38表達(dá)。定量分析結(jié)果分別以p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38蛋白表達(dá)量比值表示。成像結(jié)果采用Quantity One V 4.6軟件分析，結(jié)果重復(fù)3次。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)處理;等級(jí)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn);相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)。

3 結(jié)果

3.1各實(shí)驗(yàn)分組大鼠血清學(xué)指標(biāo)的變化

3.1.1血清ALT、AST比較 見Tab 1，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，大鼠血清中ALT、AST在模型組最高，且與正常組相比有差異有顯著性(P＜0.01)。逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期逐漸減少，其中逆轉(zhuǎn)4周、逆轉(zhuǎn)6周、逆轉(zhuǎn)8周降低明顯，與模型組相比差異均有顯著性(P＜0.05)。

Tab 1 Comparison of ALT and AST in various groups(±s，n=8)

Tab 1 Comparison of ALT and AST in various groups(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs normal;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

Group ALT/U·L－1 AST/U·L －1 Normal 29.14 ±6.92 81.11 ±8.33 Model 75.07 ±17.24＊＊ 136.12 ±14.24＊＊2 wk 61.56 ±1.42 124.64 ±12.23 4 wk 56.1 ±12.04# 119.87 ±12.11#6 wk 46.62 ±10.33## 109.07 ±11.52##8 wk 33.54 ±9.04## 96.02 ±9.54##

3.1.2各組大鼠血清LN、PⅢNP的比較 Tab 2所示，LN、PⅢNP在模型組最高，且與正常組相比有明顯差別(P＜0.01)。逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期逐漸減少，其中逆轉(zhuǎn)4周、逆轉(zhuǎn)6周、逆轉(zhuǎn)8周降低明顯，與模型組相比均有明顯差別(P＜0.05)。

Tab 2 Comparison of LN and PⅢNP in various groups(±s，n=8)

Tab 2 Comparison of LN and PⅢNP in various groups(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs normal;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

Group LN/μg·L －1 PⅢNP/μg·L －1 Normal 75.06 ±24.62 8.53 ±2.84 Model 157.53 ±51.5＊＊ 30.56 ±10.02＊＊2 wk 134.59 ±44.10 22.41 ±7.35 4 wk 107.87 ±35.24# 14.69 ±4.93##6 wk 97.47 ±31.92## 11.01 ±3.65##8 wk 87.92 ±28.72## 9.23 ±3.03##

3.2病理組織學(xué)結(jié)果

3.2.1肝組織Hyp含量比較 如Tab 3所示大鼠肝組織中的Hyp含量在模型組中最高，與正常組相比有明顯差別(P＜0.01)，逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期逐漸降低，逆轉(zhuǎn)4、6、8周降低明顯，且與模型組差異有顯著性(P＜0.05)。

Fig 1 Pathological results of the liver fibrosis rats about different recovery phases induced by CCl4

Tab 3 Comparison of Hyp in various groups(±s，n=8)

Tab 3 Comparison of Hyp in various groups(±s，n=8)

＊＊P＜0.01 vs normal;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

Group Hyp/mg·(g liver)－1 Normal 7.38 ±0.80 Model 15.30 ±3.91＊＊2 wk 13.45 ±1.96 4 wk 11.90 ±2.31#6 wk 10.22 ±2.71##8 wk 9.59 ±2.32##

3.2.2病理形態(tài)學(xué)觀察 Masson膠原染色顯示(Fig 1)，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊僅有少量血管壁著藍(lán)色。模型組肝組織有大量膠原纖維沉積，著藍(lán)色，纖維間隔較厚，形成明顯的假小葉，并伴有大量的脂肪空泡。逆轉(zhuǎn)期各組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪空泡逐漸減少，纖維沉積程度減輕，纖維間隔變窄，至恢復(fù)8周后，肝纖維化明顯減輕，提示模型有明顯的逆轉(zhuǎn)期。

Tab 4 Pathological results of the liver fibrosis rats about different recovery phases induced by CCl4(n=8)

3.3各組大鼠肝組織中MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化3.3.1ERK1/2通路蛋白表達(dá)變化 由Fig 2可見，p-ERK1/2在模型組表達(dá)最低，與正常組相比差異有顯著性(P＜0.01);逆轉(zhuǎn)2周開始逐漸升高，逆轉(zhuǎn)4周表達(dá)最高，與模型組相比差異有顯著性(P＜0.01)，逆轉(zhuǎn)6周、逆轉(zhuǎn)8周逐漸降低。

Fig 2 Relative expression levels of ERK signaling way proteins detected by Western blot(±s，n=8)

3.3.2JNK信號(hào)通路蛋白表達(dá)變化 由Fig 3可見，p-JNK1/2在肝纖維化模型期表達(dá)最低，與正常組相比差異有顯著性(P＜0.01);逆轉(zhuǎn)期逐漸增高，與模型組相比差異有顯著性(P＜0.01)。

3.3.3p38信號(hào)通路蛋白變化 由 Fig 4可見，pp38在肝纖維化模型組表達(dá)最高，與正常組相比差異有顯著性(P＜0.01)，逆轉(zhuǎn)2周表達(dá)較高與模型組差異不明顯，逆轉(zhuǎn)4周(P＜0.05)、6周、8周逐漸降低與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3.4MAPK信號(hào)通路蛋白與Hyp相關(guān)性分析結(jié)果Hyp為膠原蛋白特有的氨基酸，測(cè)定肝組織羥脯氨酸含量可間接反映肝纖維化的程度［10］。MAPK信號(hào)通路蛋白與Hyp相關(guān)性研究能夠揭示其與肝纖維化逆轉(zhuǎn)的關(guān)系。分析結(jié)果為p-ERK/ERK與Hyp相關(guān)系數(shù)r=－0.46，P=0.003;p-JNK/JNK與Hyp相關(guān)系數(shù)r= －0.53，P=0.0004;p-p38/p38與Hyp相關(guān)系數(shù)r=0.81，P=0.0001。

4 討論

CCl4皮下注射為建立肝纖維化經(jīng)典方法，誘導(dǎo)12周后停止注射后可自發(fā)逆轉(zhuǎn)［5－6］。本實(shí)驗(yàn)中反映肝損傷和肝纖維化指標(biāo) ALT、AST、Hyp、LN、PⅢNP，在CCl4皮下注射12周后明顯增加，于自發(fā)恢復(fù)2、4、6、8周逐漸降低，同時(shí)，病理組織學(xué) Masson膠原染色也顯示逆轉(zhuǎn)期，大鼠肝臟病理表現(xiàn)與肝纖維化分期逐漸改善，表明大鼠肝纖維化及其逆轉(zhuǎn)期動(dòng)物模型建立成功。Hyp為膠原蛋白特有的氨基酸，測(cè)定肝組織羥脯氨酸含量可間接反映肝纖維化的程度，是肝纖維化檢測(cè)的重要指標(biāo)，也是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)肝纖維化程度最為常用的指標(biāo)［10］。因而，研究肝纖維化逆轉(zhuǎn)期MAPK信號(hào)通路蛋白與Hyp的相關(guān)性可以進(jìn)一步揭示MAPK信號(hào)通路在肝纖維化逆轉(zhuǎn)中所起的作用。

肝纖維化為肝損傷共有的病理改變，肝損傷時(shí)肝細(xì)胞凋亡增加，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝損傷的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11］，JNK信號(hào)通路也參與調(diào)控許多細(xì)胞增殖、分化與凋亡。采用cDNA微陣列雜交和Nothern雜交法，發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)通路相關(guān)基因在肝纖維化逆轉(zhuǎn)時(shí)明顯活化［12］。本實(shí)驗(yàn)從蛋白表達(dá)角度研究顯示，肝纖維化模型期p-ERK1/2表達(dá)明顯下降，與正常組相比差異有顯著性，逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期表達(dá)逐漸增強(qiáng)，4周達(dá)最高，此后逐漸下降。肝纖維化指標(biāo)Hyp的含量亦在模型組最高，逆轉(zhuǎn)期逐漸降低，且Hyp與p-ERK/ERK表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明p-ERK的表達(dá)與肝纖維化嚴(yán)重程度有負(fù)相關(guān)性。JNK1/2蛋白在肝纖維化模型期表達(dá)明顯下降，與正常組相比差異有顯著性，逆轉(zhuǎn)期表達(dá)增加且與模型期相比差異有顯著性，表明JNK通路在肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)期亦明顯活化。p-JNK的表達(dá)與Hyp也呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明p-JNK與p-ERK的表達(dá)均與肝纖維化病變程度有負(fù)相關(guān)性。有研究顯示上調(diào)JNK蛋白表達(dá)可促進(jìn)肝細(xì)胞DNA的合成［13］，表明p-JNK表達(dá)與肝細(xì)胞增殖關(guān)系密切。文獻(xiàn)報(bào)道纖維化逆轉(zhuǎn)期肝細(xì)胞的增殖活動(dòng)明顯增強(qiáng)［14］，因而推測(cè)在肝纖維化逆轉(zhuǎn)期ERK1/2和JNK1/2信號(hào)蛋白表達(dá)增多，二者共同作用促進(jìn)肝細(xì)胞增殖可能是肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的重要機(jī)制之一。

p38信號(hào)傳導(dǎo)通路在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化等方面起著重要作用［15］，隨著肝纖維化的發(fā)展p-p38表達(dá)增多，且與α-SMA表達(dá)呈正相關(guān)，同時(shí)，免疫組化pp38表達(dá)定位于肝臟間質(zhì)細(xì)胞，推測(cè)其可能通過(guò)誘導(dǎo)HSC的活化、增殖促進(jìn)纖維化的形成［16］。本研究結(jié)果顯示，模型期p-p38蛋白表達(dá)最高，逆轉(zhuǎn)4周后蛋白表達(dá)水平明顯下降，逆轉(zhuǎn)6～8周后表達(dá)逐漸降至較低水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)p-p38/p38與Hyp呈正相關(guān)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示p-p38的表達(dá)增多能夠促進(jìn)肝纖維化形成，表達(dá)減少促進(jìn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)。由此推測(cè)肝纖維化逆轉(zhuǎn)期p-p38表達(dá)減少也可能為肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)的機(jī)制之一。

綜上所述，本研究表明MAPK信號(hào)通路與肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)關(guān)系密切。其中ERK、JNK、p38三條信號(hào)通路均參與肝纖維化逆轉(zhuǎn)恢復(fù)，ERK和JNK通路與肝纖維化逆轉(zhuǎn)期有負(fù)相關(guān)性，p38通路與肝纖維化逆轉(zhuǎn)期呈正相關(guān)。然而，肝纖維化發(fā)病和自發(fā)恢復(fù)機(jī)制復(fù)雜，參與介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路眾多，故肝纖維化逆轉(zhuǎn)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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