左旋精氨酸通過上調(diào)Th1應(yīng)答介導(dǎo)抗瘧保護(hù)性免疫

潘艷艷，劉 軍，李 瑩，延 娟，馮永輝，王各各，馮 輝，鄭 麗，曹雅明

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽 110001)

瘧疾是由瘧原蟲感染引起的嚴(yán)重威脅人類生命的感染性疾病之一。最新的統(tǒng)計(jì)顯示，全世界每年有2～3億瘧疾感染病例，病死人數(shù)高達(dá)100萬［1］。

L-Arg能夠發(fā)揮抗腫瘤、促進(jìn)傷口愈合和增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答等多種功能［2－3］。尤其是L-Arg的免疫增強(qiáng)作用已備受關(guān)注。有限的研究表明瘧疾感染患者L-Arg水平明顯降低［4］，L-Arg能夠恢復(fù)印度尼西亞患有嚴(yán)重瘧疾的成人內(nèi)皮功能以及促進(jìn)NO的產(chǎn)生［5］。IFN-γ直接或間接抑制瘧原蟲肝內(nèi)期的發(fā)育是L-Arg依賴的［6］。然而，目前關(guān)于L-Arg在瘧疾感染免疫中對(duì)Th1免疫應(yīng)答的作用尚不清楚。

本研究利用我們成功建立的P.y17XL易感鼠瘧模型，觀察了L-Arg對(duì)P.y17XL易感鼠的Th1免疫應(yīng)答影響，以期探討L-Arg在P.y17XL感染中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、瘧原蟲及主要試劑6～8周齡、♀BALB/c小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供(許可證編號(hào):SCXK京200420001);P.y17XL(日本愛媛大學(xué)分子寄生蟲學(xué)教研室惠贈(zèng));抗體均購自BD或eBioscience公司;L-Arg購自 Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染BALB/c小鼠分別經(jīng)腹腔感染1×106P.y17XL寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，感染不同時(shí)間小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率，并每日觀察生存率。

1.3動(dòng)物分組與L-Arg處理BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組:生理鹽水處理組(NC組)、感染前7天LArg處理組(L-Arg組)。每組20只小鼠。1.5 g·kg－1體質(zhì)量口服生理鹽水或L-Arg。

1.4脾細(xì)胞培養(yǎng)小鼠感染0、3和5 d無菌摘取脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，以臺(tái)盼藍(lán)液檢查脾細(xì)胞活性，確定活細(xì)胞超過90%。用含10%FCS的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度至每毫升1×107個(gè)，24孔培養(yǎng)板(FALCON)，每孔加入500 μl細(xì)胞懸液，1式3孔，培養(yǎng)48 h。350×g室溫離心10 min，收集上清，－80℃保存，待測(cè)細(xì)胞因子及NO。

1.5細(xì)胞因子及NO檢測(cè)雙抗體夾心ELISA法對(duì)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ的含量分別進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀(Inter MedNJ-2100)測(cè)定450 nm處OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量(ng·g－1)。Griess試劑檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO含量，100 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液和100 μl Griess反應(yīng)液室溫反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)550 nm處OD值，以NaNO2作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行濃度換算。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾臟CD4+CD69+T細(xì)胞、F4/80+CD36+巨噬細(xì)胞。每份樣品用抗－CD4-FITC單抗和抗－CD69-PE單抗進(jìn)行雙色分析。脾細(xì)胞懸液中加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體，再加入抗－F4/80－FITC單抗和抗－CD36－PE單抗進(jìn)行表面染色。離心去上清后，用0.5 ml細(xì)胞染色緩沖液重懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1小鼠感染不同時(shí)間原蟲血癥及其生存率如Fig 1所示，NC組小鼠感染后3 d原蟲血癥水平開始迅速上升，小鼠于感染后d 6～8全部死亡。與此相比，L-Arg組小鼠原蟲血癥上升緩慢，在感染d 16小鼠全部死亡。

2.2小鼠感染不同時(shí)間CD4+CD69+T細(xì)胞和F4/80+CD36+巨噬細(xì)胞數(shù)量如Fig 2所示，與NC組相比，L-Arg組小鼠于感染后 d 3和 d 5 CD4+CD69+T細(xì)胞和F4/80+CD36+巨噬細(xì)胞數(shù)量均出現(xiàn)升高(P＜0.05)。

2.3小鼠感染不同時(shí)間脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和NO水平如Fig 3所示，L-Arg組小鼠于感染后d 3和d 5 IFN-γ和NO水平均比NC組小鼠高(P＜0.05)。

3 討論

在紅內(nèi)期保護(hù)性免疫應(yīng)答中，CD4+T細(xì)胞發(fā)揮至關(guān)重要的作用，瘧原蟲感染早期宿主建立的以IFN-γ分泌增加為主的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答是抑制紅內(nèi)期瘧原蟲增殖的關(guān)鍵效應(yīng)機(jī)制［7］。我們發(fā)現(xiàn)，L-Arg明顯促進(jìn)了Th1免疫應(yīng)答的建立，原蟲血癥水平得到控制、生存期延長(zhǎng)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)LArg組小鼠F4/80+CD36+細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)有意義的升高。CD36是清道夫受體家族B型受體，目前認(rèn)為CD36在介導(dǎo)巨噬細(xì)胞非調(diào)理性吞噬功能中發(fā)揮重要作用［8］。研究表明CD36缺陷個(gè)體發(fā)生嚴(yán)重瘧疾的危險(xiǎn)性要明顯升高［9］。巨噬細(xì)胞是非特異性免疫效應(yīng)分子NO的重要來源，NO氧化后形成的過氧化氮是巨噬細(xì)胞發(fā)揮殺傷毒性的主要效應(yīng)分子［10］，我們發(fā)現(xiàn)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO產(chǎn)生也出現(xiàn)明顯升高。

Fig 1 The parasitemia(A)and survival rate(B)in different time after infection

Fig 2 Absolute numbers of CD4+CD69+cells(A)and F4/80+CD36+cells(B)in splenocytes in different time after infection

Fig 3 Level of in IFN-γ(A)and NO(B)in splenocyte supernatants in different time after infection

綜上，L-Arg能夠有效地增強(qiáng)易感的BALB/c小鼠感染早期Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答的建立，對(duì)于研制抗瘧新藥將具有重要的科學(xué)意義。

［1］WHO:World Malaria Report 2010［R］.http://www.who.int/malaria/world_malaria_report_2010/en/index.html.

［2］Barbul A，Lazalou S A，Efron D T，et al.Arginine enhances wound healing and lymphocyteimmune responsesin humans［J］.Surgery，1990，108(2):331 －7.

［3］楊 濤，張 偉，張 雷.L-精氨酸-NO途徑抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，26(10):1361－5.

［3］Yang T，Zhang W，Zhang L.L-Arginine-NO pathway inhibits the hypertrophic response of cultured cardiomyocytes induced by angiotensin Ⅱ［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，26(10):1361 －5.

［4］Dowling D P，Ilies M，Olszewski K L，et al.Crystal structure of arginase from Plasmodium falciparum and implications forL-Arginine depletion in malarial infection［J］.Biochemistry，2010，49(26):5600－8.

［5］Yeo T W，Lampah D A，Gitawati R，et al.Recovery of endothelial function in severe falciparum malaria:relationship with improvement in plasmaL-Arginine and blood lactate concentrations［J］.J Infect Dis，2008，198(4):602 －8.

［6］Nüssler A，Drapier J C，Rénia L，et al.L-Arginine-dependent destruction of intrahepatic malaria parasites in response to tumor necrosis factor and/or interleukin 6 stimulation［J］.Eur J Immunol，1991，21(1):227－230.

［7］Yazdani S S，Mukherjee P，Chauhan V S，et al.Immune responses to asexual blood-stages of malaria parasites［J］.Curr Mol Med，2006，6(2):187－203.

［8］Berry A，Chene G，Benoit-Vical F，et al.Ex vivo andin vitroimpairment of CD36+expression and tumor necrosis factor-alpha production in human monocytes in response to Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes［J］.J Parasitol，2005，91(2):316 －22.

［9］Aitman T J，Cooper L D，Norsworthy P J，et al.Malaria susceptibility and CD36+mutation［J］.Nature，2000，405(6790):1015－6.

［10］Fritsche G，Larcher C，Schennach H，et al.Regulatory interactions between iron and nitric oxide metabolism for immune defense against plasmodium falciparum infection［J］.Infect Dis，2001，183(9):1388－94.