對(duì)甲氧基肉桂醛左氧氟沙星酰腙誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用

付建民，王德輝，孫金平，康玉華，皇甫超申，胡國(guó)強(qiáng)，劉 彬

(河南大學(xué)1.護(hù)理學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)研究所、2.醫(yī)學(xué)院、3.化學(xué)生物學(xué)研究所，河南開封 475004)

喹諾酮類抗菌藥物主要的作用于細(xì)菌的DNA回旋酶(gyrase)，影響細(xì)菌的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)菌增殖［1］。原核生物的DNA回旋酶與真核生物的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoisomeraseⅡ，TopoⅡ)具有同源性和功能相似性，而拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ是許多重要的抗腫瘤藥物細(xì)胞內(nèi)的主要靶酶［2］。多年來(lái)人們一直試圖通過(guò)改造喹諾酮抗菌藥物的構(gòu)效關(guān)系，尋求新型抗腫瘤藥物。目前已有二環(huán)喹諾酮、三環(huán)喹諾酮、四環(huán)喹諾酮、手性喹諾酮抗有絲分裂的喹諾酮等，先后用于抗腫瘤活性的研究，但均因體內(nèi)毒性或生物利用度或穩(wěn)定性等問(wèn)題而未進(jìn)入臨床評(píng)價(jià)。因此，尋找新結(jié)構(gòu)的氟喹諾酮先導(dǎo)化合物已成為新的挑戰(zhàn)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類化合物的C-3位羧基對(duì)于其抗菌活性是必需的，但并非是抗腫瘤活性所必要的，可被某些雜環(huán)或稠雜環(huán)等生物電子等排體取代，這為尋求新結(jié)構(gòu)的抗腫瘤氟喹諾酮先導(dǎo)物提供了新的思路［3］。本課題組發(fā)現(xiàn)抗菌氟喹諾酮C-3位羧用酰腙電子等排體取代的化合物具有潛在的抗腫瘤活性。其中由左氧氟沙星衍生的化合物(S)N-(3-對(duì)甲氧基苯亞丙烯基-6-氟-7-(4-甲基哌嗪-1-基)-1，8-(3，1-丙氧基)-喹啉-4(1H)酮-3-甲酰肼(FQ-10，F(xiàn)ig 1)具有較強(qiáng)活性，IC50值達(dá) 4.40 μmol·L－1。為進(jìn)一步了解該化合物抑制細(xì)胞增殖作用的機(jī)制，課題組利用人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，對(duì)該化合物抑制細(xì)胞的增殖的機(jī)制進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Fig 1 Structure of(S)N-(3-p-methoxylphenyl)-6-fluoro-7-(4-methylpiperazin-1-yl)-1，8-(3，1-propoxy)-quinolin-4(1H)-one-3-carbonyl hydrazine

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1誘導(dǎo)劑對(duì)甲氧基肉桂醛左氧氟沙星酰腙由河南大學(xué)藥物化學(xué)研究所提供，HPLC法測(cè)定純度＞99%，溶解在二甲基亞砜(DMSO，Solarbi公司)中，濃度為1 ×10－2mol·L－1。

1.1.2細(xì)胞株和主要試劑人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，生長(zhǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)中，置體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。

四甲基偶氮唑鹽(MTT)，DeadEndTMFluorometric TUNELSystem(promega公司);caspase-9、caspase-8、caspase-3、p53、Bcl-2、Bax 抗體(碧云天公司);β-actin抗體(Santa Cruz公司)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、DNA ladder抽提試劑盒;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(中衫金橋公司);Hoechst 33258(Sigma公司)。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma，3121，USA);酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan Ascent，USA);BX51熒光顯微鏡(Olympus公司);DYY-7C型轉(zhuǎn)移電泳儀;半干式電轉(zhuǎn)裝置;凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠);高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific USA)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞以1×107·L－1濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入不同濃度的FQ-10分別培養(yǎng)24、48、72 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 0.15 ml振蕩10 min，至藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm吸收度(A)值并計(jì)算抑制率。以含等體積的培養(yǎng)液和DMSO的無(wú)細(xì)胞孔測(cè)的吸光度值為空白對(duì)照。根據(jù)中效方程式［fa/fu=(D/Dm)m］計(jì)算出中效濃度(IC50)［4］。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率/%=［1－(處理組吸收度－空白對(duì)照組吸收度)/(對(duì)照組吸收度－空白對(duì)照組吸收度)］×100%。

1.2.2 Hoechst 33258/PI雙染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化以1×107·L－1細(xì)胞數(shù)接種于放置蓋玻片的六孔板，加入不同濃度的FQ-10培養(yǎng)24 h，去培養(yǎng)液后加入終濃度為5 mg·L－1的Hoechst33258避光染色10 min，再加入終濃度為15 mg·L－1的PI避光10 min，去染液，加入4%多聚甲醛4℃固定5 min，熒光顯微鏡下觀察拍攝。

1.2.3 TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡率取1×107·L－1細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞于放置蓋玻片的六孔板，用不同濃度的FQ-10作用24 h，按Promega公司的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳觀察細(xì)胞凋亡的梯狀DNA條帶在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中加入不同濃度的FQ-10培養(yǎng)24 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶消化處理后收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，按DNA ladder抽提試劑盒說(shuō)明書提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍攝。

1.2.5線粒體膜電位(△ψm)測(cè)定在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中加入不同濃度的FQ-10培養(yǎng)24 h后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液和JC-1染色工作液各1 mL，37℃孵育20 min，加入終濃度為5 mg·L－1的 Hoechst33258 避光染色10 min，PBS洗滌，高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察分析。

1.2.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)不同濃度FQ-10作用細(xì)胞24 h，RIPA裂解液200 μl充分裂解細(xì)胞，4℃離心(12 000 r·min－1)5 min 提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G250法分光光度計(jì)測(cè)樣品蛋白濃度，以12%SDS-PAGE電泳分離。電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶2 000)4℃封閉過(guò)夜，二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠抗體1∶4 000)孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有資料均采用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1FQ10對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用不同濃度的FQ-10分別作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h、48 h和72 h，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖抑制作用，抑制率呈濃度和時(shí)間依賴性。24、48 h和72 h的IC50值分別為 4.40 μmol·L－1(r2=0.822 1)，3.65 μmol·L－1(r2=0.799 0)和 3.61 μmol·L－1(r2=0.783 3)，見(jiàn) Fig 2。

Fig 2 Proliferation inhibition effect of FQ-10 on SMMC-7721 cells

2.2 FQ10誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡作用Hoechst33258/PI雙染結(jié)果顯示，F(xiàn)Q-10作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h，出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮、染色質(zhì)凝集、核呈碎片狀等凋亡形態(tài)學(xué)變化，晚期可見(jiàn)特異性PI染色(Fig 3)。TUNEL結(jié)果顯示，隨著FQ-10濃度增加，凋亡細(xì)胞明顯增多，呈濃度依賴性(Fig 4)。DNA凝膠電泳顯示，F(xiàn)Q-10(10 μmol·L－1)處理組的基因組DNA呈現(xiàn)典型的梯狀條帶，對(duì)照組細(xì)胞DNA完整(Fig 5)。

2.3FQ-10對(duì)線粒體膜電位的影響JC-1正常在線粒體內(nèi)形成多聚體，呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞內(nèi)△ψm破壞，使JC-1以單體的形式進(jìn)入胞質(zhì)呈綠色熒光。熒光強(qiáng)度比值的變化反映△ψm的變化。SMMC-7721 細(xì)胞經(jīng)1.48、4.40、10.00 μmol·L－1FQ-10 作用24 h后，每孔綠色熒光強(qiáng)度與紅色熒光強(qiáng)度比值隨藥物濃度增加而增大，表明細(xì)胞線粒體膜電位降低。與對(duì)照組相比分別降低(9.24±4.68)%，(35.16±5.06)%，(43.80±3.25)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn) Fig 6。

Fig 3 SMMC-7721 cells apoptosis under fluorescent microscope stained by Hoechst 33258/PI(×200).

Fig 4 Induction of apoptosis of SMMC-7721 cells treated with FQ-10 for 24 h evaluated by TUNEL assay

Tab 1 Apoptotic effects of FQ-10 on SMMC-7721 cells(±s，n=9)

Tab 1 Apoptotic effects of FQ-10 on SMMC-7721 cells(±s，n=9)

*P＜0.05 vs control

Group Dose/μmol·L －1Total cell Apoptotic cell Apoptotic ratio/%Control 128.75 ±16.50 8.76 ±3.75 6.48 ±2.08 FQ-10 1.48 146.32 ±10.86 23.43 ±8.75 16.01 ±5.56*4.40 187.29 ±12.68 34.26 ±6.43 18.69 ±2.26*10.00 142.76 ±11.23 39.85 ±7.84 27.94 ±3.23*

Fig 5 DNA fragmentation in SMMC-7721 cells

Fig 6 Changes in the MMP of SMMC-7721 cells induced by FQ-10 for 24 h and analyzed by HCS after staining with JC-1

2.4FQ-10對(duì)凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響以1.48、4.40、7.32 和 10.00 μmol·L－1FQ-10 分別作用于 SMMC-7721細(xì)胞 24 h，Western blot法檢測(cè)caspase-9，caspase-8，caspase-3，Bcl-2，Bax 和 p53 的表達(dá)。與對(duì)照組相比，F(xiàn)Q-10作用后細(xì)胞p53蛋白表達(dá)明顯增加，Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax的蛋白表達(dá)量隨加藥濃度的增高而增加，呈明顯的濃度依賴關(guān)系;抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達(dá)則略有下調(diào)。細(xì)胞凋亡可通過(guò)兩條途徑實(shí)現(xiàn)，一條是線粒體途徑，另一條是膜死亡受體介導(dǎo)途徑。前者主要通過(guò)激活caspase-9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而后者主要通過(guò)激活caspase-8實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。Fig 7顯示，F(xiàn)Q-10作用后Caspase-9蛋白總體表達(dá)水平增高，活化裂解片段增多，同時(shí)caspase 3活化片段亦有增加，而caspase-8變化不明顯，提示FQ-10誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡作用可能僅與線粒體凋亡通路有關(guān)。

Fig 7 Protein expression of caspase-9，caspase-8，caspase-3，Bcl-2，Bax and p53 in SMMC-7721 cells treated with different FQ-10 concentrations for 24 h

3 討論

氟喹諾酮類化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用已見(jiàn)報(bào)道［5］。本實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)Q-10對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721有較強(qiáng)的增殖抑制作用，且呈時(shí)間和濃度依賴性，可能成為一種有價(jià)值的候選抗腫瘤藥物。研究中發(fā)現(xiàn)，在低劑量條件下，F(xiàn)Q-10對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的殺傷作用不足，殘存少量耐藥細(xì)胞密度適中，能夠很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間(72 h和48 h)處理組的增殖抑制率低于24 h處理組(Fig 2)，值得注意。

臨床常用抗菌氟喹諾酮類藥物作用于細(xì)菌的DNA回旋酶，此酶與真核生物拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ在活性部位酪氨酸附近的序列有同源性［6］，部分氟喹諾酮類藥物如氧氟沙星、環(huán)丙沙星等，對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ有很弱的抑制作用［7］。已有報(bào)道［8］，經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后，某些氟喹諾酮類藥物顯示出較強(qiáng)的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制作用，作用機(jī)制類似于抗癌藥物依托泊苷［9］，主要通過(guò)促進(jìn)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ介導(dǎo)的DNA解旋或斷裂，抑制其再連接反應(yīng)，造成細(xì)胞DNA損傷。資料顯示，喹諾酮類化合物致DNA損傷多通過(guò)激活p53蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10－11］。本實(shí)驗(yàn) Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)Q-10可使p53蛋白表達(dá)明顯增多，同時(shí)細(xì)胞凋亡率也隨FQ-10濃度增加明顯升高，說(shuō)明FQ-10誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用與激活p53蛋白有關(guān)。

一般認(rèn)為，經(jīng)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ毒性作用造成的DNA損傷，可能激活線粒體凋亡途徑和膜死亡受體途徑造成細(xì)胞凋亡，線粒體途徑受Bcl-2家族控制［12－13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 FQ-10可上調(diào)促凋亡Bax的表達(dá)，下調(diào) Bcl-2的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)作用與FQ-10劑量一致，說(shuō)明FQ-10誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡作用與線粒體凋亡通路有關(guān)［14］。通過(guò)高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)FQ-10可以引起SMMC-7721細(xì)胞線粒體膜電位降低，這種變化主要由線粒體膜通透性增加所致，促使線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)caspase-9和caspase-3激活途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有報(bào)道喹諾酮類化合物可經(jīng)膜死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但FQ-10對(duì)caspase-8的影響并不顯著，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用可能與膜死亡受體途徑無(wú)關(guān)［15］。

綜上所述，喹諾酮類化合物FQ-10可抑制肝癌細(xì)胞增殖，造成DNA損傷，經(jīng)p53蛋白作用激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡。

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