噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲及其銀離子配合物對EC109增殖和凋亡影響

李曉娟，曹更生，劉廣超，李明雪，張 洪

(河南大學(xué)1.生命科學(xué)院生物工程研究所、河南省重點學(xué)科動物轉(zhuǎn)基因與細胞工程開放實驗室，2.醫(yī)學(xué)院、河南省天然藥物與免疫工程重點實驗室，3.化學(xué)化工學(xué)院分子與晶體工程研究所，河南 開封 475004)

縮氨基硫脲(N)及衍生物由于具有廣泛的生物活性而備受人們的重視，尤其研究其抗腫瘤活性成為熱點。研究發(fā)現(xiàn)，很多這類化合物物因含有N、S等雜原子和C=N 基團很容易與多種金屬離子形成穩(wěn)定的配合物，且形成配合物后生物活性明顯不同。進一步的研究表明，在縮氨基硫脲化合物中，含有完整的=N1NH(CS)N4H-結(jié)構(gòu)是縮氨基硫脲化合物具有生物活性的基本活性單元，而縮氨基硫脲中N(1)上醛酮的不同結(jié)構(gòu)及N(4)上不同結(jié)構(gòu)的活性基團，對其抗菌、抗病毒和抗腫瘤等多種生物活性的強弱將產(chǎn)生極大的影響［1－3］。本文合成了噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲和新型化合物噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲銀(N-Ag)，并對其抗腫瘤生物活性進行體外評價，研究了噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲銀對食道癌細胞EC109凋亡的影響。為研發(fā)新合成的抗腫瘤藥物提供參考。

1 材料

1.1儀器Mμltiskan Asent全自動酶標儀(美國Thermo公司);EPICSXL型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司);XD-202型熒光倒置顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司);BHC-1300ⅡA2型生物安全柜(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2供試材料和試劑新型化合物噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲和金屬配合物噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲銀結(jié)構(gòu)如下:

其粉劑溶于二甲亞砜。MTT、吖啶橙(AO)、臺盼藍、胰蛋白酶、碘化丙啶(PI)、RNA酶A(均來自Sigma公司)，AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物有限公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青公司)。

1.3細胞食道癌細胞EC109(河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供)。

2 方法

2.1化合物的合成［4］配體2-噻吩甲醛-N(4)-甲基縮氨基硫脲的合成:4-甲基-3-氨基硫脲(0.44 g，4 mmol)和2-噻吩甲醛(0.45 g，2 mmol)置于盛有30 ml乙醇的燒瓶中，滴加5滴冰醋酸，攪拌回流2 h，抽濾，得到深棕色固體，其分子量為198。

2-噻吩甲醛-N(4)-甲基縮氨基硫脲合銀的合成:將 AgNO3(0.35 g，2 mmol)和 2-噻吩甲醛-N(4)-甲基縮氨基硫脲(0.4 g，2 mmol)懸浮于50 ml乙醇溶劑中，立即變?yōu)樯罴t色溶液，攪拌回流1 h后，冷卻至室溫，過濾，得紅棕色晶體，其分子量為2129.31。

2.2細胞培養(yǎng)食道癌細胞EC109接種于含有10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)。

2.3細胞生長抑制測定

2.3.1增殖抑制率的測定取傳代培養(yǎng)的對數(shù)生長期的EC109，制成1×108個·L－1的細胞懸液，接種于96孔細胞板中，每孔200 μl，隔夜孵育后分別加入藥物N和N-Ag，兩種藥物濃度設(shè)置為8個濃度梯度，藥物組 N 最大終濃度為157.83 μmol·L－1，藥物組 N-Ag 的最大終濃度為 14.68 μmol·L－1，依次二倍稀釋。每個劑量設(shè)置4個復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零孔和對照孔。5%CO2、37℃、飽和濕度下培養(yǎng)48 h 后，加入20 μl 5 g·L－1的MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄上清。加入150 μl DMSO，振蕩后用酶標儀在波長為570 nm測吸光度，參考波長為630 nm。按照下列公式求出腫瘤細胞的生長抑制率(IR):IR=［1－(實驗組平均吸光值－調(diào)零組平均吸光值)/(對照平均吸光值－調(diào)零組平均吸光值)］×100%。陰性對照組為不加藥物等量的培養(yǎng)基。

2.3.2生長曲線的測定同樣采用上述MTT比色法測定。分4組:陰性對照組(不加藥物的培養(yǎng)基)、濃度為 39.50 μmol·L－1N 組、兩個濃度 1.83 μmol·L－1(1)、3.67 μmol·L－1(2)N-Ag 組，分別不同時間處理EC109細胞，測定其對該細胞增殖抑制情況。

2.4細胞形態(tài)學(xué)分析

2.4.1吉姆薩染色取對數(shù)生長期EC109細胞接種于24孔板中，培養(yǎng)16 h后，隨機分3組:藥物組N(終濃度為 39.50 μmol·L－1)、藥物組 N-Ag(終濃度為 3.67 μmol·L－1)、陰性對照組(不加藥物的培養(yǎng)基)，培養(yǎng) 4、8、24 h 后吸去培養(yǎng)基，PBS 漂洗，體積分數(shù)0.70的甲醇固定，吉姆薩染液30 min，光鏡下觀察。

2.4.2熒光染色取對數(shù)生長期EC109細胞接種于24孔板中，培養(yǎng)16 h后，藥物分3組處理細胞同2.4.1，培養(yǎng)4、8、24 h 后吸取培養(yǎng)基，PBS 漂洗，每孔加入90 μl的 PBS，10 μl的吖啶橙溶液，混勻放置5 min后在熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期分布

2.5.1AnnexinⅤ-FITC/PI雙染收集不同濃度的N、N-Ag兩種藥物作用4 h的EC109細胞，細胞密度在1×108個·L－1以上，PBS洗2次，按照試劑盒說明書操作。流式細胞儀檢測，激發(fā)波長488nm。2.5.2PI單染檢測凋亡峰及細胞周期分布分別收集用濃度 3.67 μmol·L－1的 N-Ag 處理 4、8、12 h的EC109細胞1×109個·L－1以上，同時設(shè)置陰性對照組。PBS洗滌2次后用預(yù)冷的體積分數(shù)為0.70的酒精固定24 h以上，離心去固定液，PBS洗滌2～3次后重懸于0.5 ml含100 mg·L－1PI和100 mg·L－1RNaseA的染液中，4℃下避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期變化。細胞凋亡率用APO(%)表示。見Tab 1。

Tab 1 Effect of medicine N-Ag on cell cycle distribution and apoptosis of EC109 cells

2.6統(tǒng)計學(xué)方法采用Origin7.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)檢驗。實驗結(jié)果以±s表示，采用ANOVO單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲(N)及其過渡金屬配合物噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲銀(N-Ag)體外對食道癌細胞EC109增殖的抑制作用

3.1.1如Fig 1(A)所示，不同濃度的兩種藥物N、N-Ag分別處理食道癌細胞EC109 48 h后，N-Ag對食道癌細胞EC109增殖的抑制作用明顯。在藥物N-Ag濃度 0.92 ～14.68 μmol·L－1范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，抑制率也增加，有顯著的量效關(guān)系;而其配體N對細胞增殖的影響相對不明顯，差異沒有顯著性，抑制率在0.1～0.2左右(P＜0.05)。

3.1.2生長曲線的測定如Fig 1(B)所示，濃度為39.50 μmol·L－1配體 N 處理 EC109 細胞，隨著時間的延長，并不呈現(xiàn)時間依賴性;藥物組N-Ag(1)和(2)在4 h就出現(xiàn)較高的抑制率，分別為0.392±0.085和0.522±0.064，且隨時間延長，抑制率穩(wěn)定上升，有明顯的時間依賴性(P＜0.05)。

3.2噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲及其過渡金屬配合物噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲銀對細胞EC109的形態(tài)學(xué)影響

3.2.1吉姆薩染色如Fig 2所示，兩種藥物處理4 h后，加藥組N中的EC109細胞生長良好，加藥組N-Ag中的EC109出現(xiàn)細胞變圓漂浮，細胞核皺縮、染色加深、胞膜出現(xiàn)小泡等特征。

3.2.2熒光染色熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化見Fig 3。對照組細胞結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)較豐富，呈均勻的橘黃色或黃綠色熒光，核大呈黃色或黃綠色均勻熒光。藥物N處理的EC109細胞在不同時間均生長良好，形態(tài)同正常細胞，藥物 N-Ag處理的EC109 細胞在濃度3.67 μmol·L－14 h出現(xiàn)細胞核致密濃染，固縮成新月狀，細胞表面出現(xiàn)凋亡小體狀小泡，有的細胞熒光染色減弱或消失呈壞死癥狀。

3.3流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周期分布

3.3.1AnnexinⅤ-FITC/PI檢測細胞凋亡情況分析

藥物N-Ag隨著劑量的加大，發(fā)生凋亡的數(shù)目增多;如 Fig 4 中，C，D 為濃度為 1.83 μmol·L－1和3.67 μmol·L－1的藥物 N-Ag，其早期凋亡率分別為4.95%和11.63%。與對照組 A(早期凋亡率1.11%)相比，差異有顯著性(P＜0.05﹚，B為藥物組 N(39.50 μmol·L－1)早期凋亡僅為 2.3%。

Fig 1 Inhibitory effect of medicines N and N-Ag on the proliferation of EC109

Fig 2 Morphological changes of EC109 cells observed by Giemsa staining(×400)

Fig 3 Morphological changes of EC109 cells observed by AO fluorescence Staining(×400)

Fig 4 Effect of medicines N and N-Ag on early apoptosis of EC109 cells by flow cytometry

3.3.2PI單染檢測細胞凋亡及細胞周期分布結(jié)果見Tab 1。從Tab 1看出，與陰性對照組同時間段相比，藥物N-Ag組的G0/G1時期細胞增加，S期變化不明顯，G2/M時期細胞同比下降。加藥組細胞周期被阻滯于G0/G1期。凋亡量隨時間增加而增加，但是無明顯凋亡峰出現(xiàn)。

4 討論

本研究表明，噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲(N)及其過渡金屬配合物噻吩-N-4甲基縮氨基硫脲銀(NAg)對食道癌EC109細胞在體外的生長抑制作用不同。在一定的范圍內(nèi)，N-Ag對食道癌EC109細胞生長抑制作用，隨藥物濃度增加或作用時間延長而增強，成明顯量效和時效關(guān)系。起效濃度低，IC50值僅為2.24 μmol·L－1。與此對應(yīng)的是，配體N卻沒有對食道癌EC109細胞在體外的生長有明顯的抑制作用。顯然，Ag+的絡(luò)合是藥物活性改變的關(guān)鍵。這與以前的工作［4］，藥物對肝癌細胞SMMC7721的生長抑制作用的研究結(jié)果是一致的。

在探究藥物抗腫瘤細胞的機制方面，被大家認可的是，能否引起腫瘤細胞凋亡已成為評價抗癌藥物的一項重要指標［5］。我們在對N-Ag誘導(dǎo)食道癌EC109細胞凋亡研究中發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，藥物濃度越大，細胞凋亡出現(xiàn)的越早。N-Ag終濃度為3.67 μmol·L－1，藥物作用 4 h，通過吉姆薩、熒光染色法分別清晰觀察到食道癌EC109細胞凋亡小體的出現(xiàn)。與此對應(yīng)，卻沒有觀察到配體N誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞凋亡小體。進一步通過流式細胞儀檢測表明，N-Ag主要誘導(dǎo)食道癌EC109細胞早期凋亡，藥物濃度過大容易導(dǎo)致細胞壞死。細胞周期分布研究表明，凋亡細胞大都被阻滯于G0/G1期。已有的文獻報道，藥物誘導(dǎo)的凋亡細胞受阻于G0/G1期不能進入S期［6］或細胞周期阻滯于 G2/M 而引發(fā)凋亡［7］。藥物N-Ag可能是通過阻滯細胞周期而引發(fā)細胞凋亡的。

近期細胞凋亡的研究表明，細胞凋亡與一些調(diào)節(jié)分子活性有關(guān)，如下調(diào) Survivin表達和提高Caspase-3活性［8］等。N 與 Ag+絡(luò)合成 N-Ag，分子組成、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的同時，抗腫瘤細胞活性如何產(chǎn)生，或許是一個有趣的課題;N-Ag如何與引起細胞凋亡的調(diào)節(jié)分子相互作用的研究，或許是需要進一步研究的內(nèi)容。

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