續(xù)隨子中千金二萜烷化合物抑制人婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性的研究

王思明，王 溪，蘇曉會(huì)，張嫚麗，董 玫，史清文

(河北醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017)

續(xù)隨子(Euphorbia lathyris)系大戟科大戟屬植物，廣泛分布或栽培于歐洲、北非、中亞、東亞和南北美洲，中國引種栽培已久［1］。續(xù)隨子在臨床上主要用于治療水腫、痰飲、積聚、漲滿和血瘀閉經(jīng)等癥［2］，現(xiàn)代藥理研究表明［3－4］續(xù)隨子中獨(dú)特的千金二萜烷成分具有P-糖蛋白抑制劑和酪氨酸酶抑制劑等多種藥理活性。本文首次以續(xù)隨子中純化的三種千金二萜烷化合物為研究對象，進(jìn)行了體外抑制人婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)，并探討了千金二萜烷化合物結(jié)構(gòu)與抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性之間的構(gòu)－效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1受試物3種千金二萜烷化合物:Euphorbia Factor L1(化合物1)、Euphorbia Factor L2(化合物2)和Euphorbia Factor L3(化合物3)由史清文教授從大戟科大戟屬植物續(xù)隨子中分離得到，均為白色針晶，經(jīng)核磁共振光譜和質(zhì)譜確定結(jié)構(gòu)(Fig 1)，純度99%。

Fig 1 Chemical structures of lathyrane diterpenoids from Euphorbia lathyris

1.2藥品和試劑噻唑藍(lán)(MTT，Sigma，M-2128);RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);順鉑(Sigma，034k3693)。

1.3細(xì)胞系和培養(yǎng)條件子宮頸癌細(xì)胞 (HeLa)、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 (HEC-1)、人卵巢透明癌細(xì)胞(SHIN3和HOC-21)和人卵巢囊腺癌細(xì)胞(HAC-2)由日本千葉大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。各腫瘤細(xì)胞接種于直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4方法參照文獻(xiàn)［5］中的方法，將被試細(xì)胞懸浮接種于96孔板，每孔50 μl(含1×104個(gè)細(xì)胞)，分別加入磷酸鹽緩沖液(PBS)、溶劑對照(終濃度0.1%DMSO)、陽性對照順鉑和終濃度為100和1 μmol·L－1的化合物 1 ～3 各 50 μl，每組均設(shè) 3 復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入5 g·L－1四氮唑鹽 (MTT)10 μl，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD值)，測定波長λ=570 nm，參考波長λ=630 nm，并計(jì)算細(xì)胞生存率，細(xì)胞生存率/%=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用±s表示;兩組間數(shù)據(jù)用t-檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析。應(yīng)用SAS612統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1化合物1～3對體外培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果如Fig 2所示，陽性對照順鉑顯示較強(qiáng)的抑制HeLa細(xì)胞增殖的活性，1、10和100 μmol·L－1順鉑處理 HeLa細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞生存率分別為80.87%、56.83%和33.72%;化合物1和3用相同的劑量處理HeLa細(xì)胞后，其腫瘤細(xì)胞生存率分別 為 92.41%、55.28%、24.96% 和 82.41%、41.06%、13.24%，并且與空白對照組相比較差異具有顯著性，提示化合物1和3有較強(qiáng)的抑制HeLa細(xì)胞增殖的作用。通過腫瘤細(xì)胞生存率對被試化合物濃度的對數(shù)回歸方程，得到順鉑、化合物1和3對HeLa細(xì)胞增殖抑制的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為20.18、16.74 和 1.01 μmol·L－1?；衔?2 用 100 μmol·L－1劑量處理 HeLa細(xì)胞，細(xì)胞生存率為65.15% ，EC50大于 100 μmol·L－1。

Fig 2 Effect of three lathyrane diterpenoids on the proliferation of HeLa cells

2.2化合物1～3對子宮內(nèi)膜癌、人卵巢透明癌和人卵巢囊腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果如Tab 1所示，陽性對照順鉑對人卵巢囊腺癌細(xì)胞(HAC-2)的增殖顯示中等程度的抑制活性，EC50為20.84 μmol·L－1，而對 HEC-1、SHIN3 和 HOC-21 細(xì)胞的增殖不顯示任何抑制活性;化合物3除對HEC-1細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性外，對SHIN3、HOC-21和HAC-2細(xì)胞的增殖均顯示抑制活性，其EC50分別為16.81、51.02 和 76.49 μmol·L－1;化合物 1 和 2 對4種人婦科腫瘤細(xì)胞的增殖不顯示抑制活性，EC50均大于 100 μmol·L－1。

Tab 1 Effect of three lathyrane diterpenoids on the proliferation of HEC-1，SHIN3，HOC-21 and HAC-2 cells

3 討論

癌癥是威脅人類健康的一大兇手，嚴(yán)重地威脅人類的健康和生命，婦科腫瘤又是臨床最常見的惡性腫瘤，手術(shù)和放療是婦科腫瘤常用的治療手段，療效肯定，但是中、晚期患者的治療效果迄今仍較差，5年生存率在50%左右。目前臨床上應(yīng)用的抗癌藥物雖然種類不少，但價(jià)格昂貴，毒副作用嚴(yán)重，而且很多患者不能耐受，使其應(yīng)用受限。因此尋找療效確切，作用機(jī)制清楚，治愈率高，毒副作用小的抗癌藥物，攻克癌癥成為全世界醫(yī)藥工作者亟待解決的一大課題。

植物在其漫長的進(jìn)化過程中合成了許多結(jié)構(gòu)各異的次生代謝天然產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物具有不同的生物活性，如丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡，女貞子多糖可影響黑色素瘤細(xì)胞黏附能力等［6－7］。

續(xù)隨子為大戟科大戟屬植物，其含有的二萜、三萜、香豆素和揮發(fā)油等化學(xué)成分具有抗增殖、抗炎癥和細(xì)胞毒性等多種重要的生理活性［8－9］。本實(shí)驗(yàn)選用的續(xù)隨子中提取純化的具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的3種千金二萜烷化合物 Euphorbia Factor L1(1)、Euphorbia Factor L2(2)和Euphorbia Factor L3(3)是生物體中合成多種二萜化合物的前體物［3］，因此對這類化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的探討就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Euphorbia Factor L3(3)對子宮頸癌細(xì)胞、卵巢透明癌和卵巢囊腺癌細(xì)胞增殖均有明顯的抑制作用，而Euphorbia Factor L1(1)僅對子宮頸癌細(xì)胞的增殖顯示較強(qiáng)的抑制活性，Euphor-bia Factor L2(2)對5種實(shí)驗(yàn)用人婦科腫瘤細(xì)胞的增殖均不顯示任何抑制活性，試驗(yàn)結(jié)果推測千金二萜烷化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性與母核上的環(huán)外雙鍵及鄰位取代基有關(guān)，環(huán)外雙鍵鄰位有大的取代基時(shí)可以改變環(huán)外雙鍵的空間取向，因而影響其生物活性［10－12］。

［1］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志［M］，第7卷.北京:科學(xué)出版社，1979:44，69－71.

［1］Delectis florae republicae popularis sinicae agendae academiae sinicae.Flora Republicae Popularis Sinicae［M］.Beijing:Science Press，1979:44，69－71.

［2］Liao S G，Zhang Z J，Yang S P.Lathyranoic acid A:first secolathyrane diterpenoid in nature fromEuphorbia lathyris［J］.Org Lett，2005，7(7):1379 －82.

［3］Appendino G，Trom G C，Jarevang T，et al.Unnatural natural products from the transannular cyclization of lathyarae diterpenes［J］.Org Lett，2001，7(11):1609 －12.

［4］Appendino G，porta C D，Conseil G，et al.A new p-glycoprotein inhibitor form the caper spurge(Euphorbia lathyris)［J］.J Zat Prod，2003，66(1):140 －2.

［5］司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)［M］.北京:世界圖書出版社，1996:134－8.

［5］Situ Z Q.Cell Culture［M］.Beijing;World Book Publishing Company，1996:134－8.

［6］戴支凱，石京山，吳 芹，等.丹參酮ⅡA誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(11):1505－8.

［6］Dai Z K，Shi J S，Wu Q，et al.Apoptosis inducing effect of Tanshinone ⅡA on human lung adenocarcinoma A549 cells［J］.Chin Pharmacol Bulle，2010，26(11):1505 －8.

［7］李 璘，邱蓉麗，程 革，等.女貞子多糖對黑色素瘤細(xì)胞黏附能力的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(10):1367－9.

［7］Li L，Qiu R L，Cheng G，et al.The adhesion effect of Ligustrum lucidum Ait polysaccharide on melanoma B16BL6in vitro［J］.Chin Pharmacol Bulle，2009，25(10):1367－9.

［8］Fatope MO，Zeng L，Ohayaga J E，et al.Selectively cytotoxic diterpenes fromEuphorbia lathyris［J］.J Med Chem，1996，39(4):1005－8.

［9］Lima E M，Medeiros J M，Davin L B.Pentacyclic triterpenes fromEuphorbiastygiana［J］.Phytochemistry，2003，63(4):421 －5.

［10］Jassbi A R.Chemistry and biological activity of secondary metabolites in Euphorbia from Iran［J］.Phytochemistry，2006，67(18):1977－84.

［11］Duarte N，Varga A，Cherepnev G，et al.Apoptosis induction and modulation of P-glycoprotein mediated multidrug resistance by new macrocyclic lathyrane － type diterpenoids［J］.Bioorga Med Chem，2007，15(1):546 －54.

［12］Shi Q W，Su X H，Kiyota H.Chemical and pharmacological research of the plants in genus Euphorbia［J］.Chem Rev，2008，108:4295－327.