姜黃素對食管癌EC-109細胞增殖抑制的研究

胡 輝 荊緒斌 蔡先彬 王欽加

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚類色素，其抗腫瘤效應近年來受到研究者關注,實驗證實姜黃素有確切的抗腫瘤活性[1～4]。我們前期研究也證實了姜黃素有抗食管癌作用，其作用機制仍有待進一步研究[5]。本研究通過檢測不同濃度姜黃素作用食管癌EC-109細胞后的細胞增殖情況、細胞周期各時相分布情況和cyclin D1、cyclin E表達情況，以初步闡述姜黃素抑制食管癌細胞增殖的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

姜黃素購于成都思科華公司,噻唑藍(MTT)、二甲基亞楓(DMSO)購自SIGMA公司，碘化丙啶(PI)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，胰蛋白酶(Tyrisin)購自Promega公司,兔抗cyclin D1、cyclin E抗體和辣根過氧化物酶(HPR)標記的羊抗兔抗體購于Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人食管癌Ec-109細胞復蘇后培養(yǎng)在含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，每周傳代2次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。人食管癌Ec-109細胞為汕頭大學醫(yī)學院病理室饋贈。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制情況 將細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，含5×105個細胞。實驗設空白組、腫瘤細胞陰性對照組、姜黃素治療組，治療組中加入等體積不同濃度姜黃素。將培養(yǎng)板置于37℃，飽和濕度，5%CO2培箱中常規(guī)培養(yǎng)12、24、48 h后，各孔均加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，各孔均加入DMSO 150 μl，振蕩器上振蕩5 min溶解藍色結晶，混勻后以酶標儀于490 nm處讀取各孔吸光度值(A490)。腫瘤細胞的增殖抑制率=(1-實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%，空白組吸光度值設為0值。實驗重復4次，取平均值。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期情況 姜黃素溶解于DMSO中，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋，樣品中DMSO終濃度<0.5%。細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，生長至80%融合，加入稀釋終濃度為20、40、80 μmol/L姜黃素后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對照組不加姜黃素，胰酶消化，PBS洗滌細胞2次，離心(1000 r/min×10 min，離心半徑13.5 cm)。70%乙醇4℃固定過夜，碘化丙啶避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過濾后流式細胞儀檢測細胞周期分布情況，檢測細胞數(shù)為1×106個。根據(jù)細胞周期各時相分布情況計算細胞增殖指數(shù)(proliferation index,PI)。Pl(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。實驗重復4次，取平均值。

1.2.4 Western-blot檢測cyclin D1、cyclin E表達 20、40、80 μmol/L的姜黃素分別作用細胞24 h后，細胞先經(jīng)冷PBS沖洗3遍，收集細胞(1×108/ml)，用加樣緩沖液裂解細胞，勻漿緩沖液(250 μmol/L Sucrose,20 μmol/L Hepes/KOH，pH 7.5，10 μmol/L KCl，1.5 μmol/L MgCl2，1 μmol/L EGTA，1 μmol/L EDTA，1 μmol/L DTT，0.1 μmol/L PMSF)400 μl重懸，移入玻璃勻漿器內(nèi)，于冰浴中勻漿5 min，離心(10 000 r/min×10 min，離心半徑9.5 cm)，收集上清，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，制備好的蛋白樣品置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ?0 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)12%聚丙烯酞胺凝膠SDS-PAGE電泳后，電轉膜至硝酸纖維膜。室溫封閉3 h，加兔抗cyclin D1、cyclin E抗體，室溫下孵育2 h，再加HRP標記的羊抗兔抗體，室溫下孵育1 h，采用DAB顯色試劑盒進行顯色約2 min，以β-actin蛋白作為陽性對照，待蛋白條帶顯色清晰時，拍攝照片，記錄實驗結果。

1.3 統(tǒng)計學處理

計量資料采用均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)行方差分析，如有統(tǒng)計學意義再行均數(shù)間多重比較。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理。

2 結果

2.1 姜黃素抑制細胞增殖情況

20、40、80 μmol/L姜黃素分別作用于食管癌EC-109細胞12、24、48 h后，采用MTT法分析，證實細胞吸光度值隨作用時間延長及藥物濃度增加而增大，實驗組吸光度值與對照組比較均有統(tǒng)計學意義(F=64.795，P<0.05)。相同時間組內(nèi)或相同劑量組內(nèi)吸光度值兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；細胞增殖抑制率呈現(xiàn)同樣趨勢(F=71.40，P<0.00)，相同時間組內(nèi)或相同劑量組內(nèi)兩兩比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明姜黃素能抑制EC-109細胞的增殖，并呈一定的時間、劑量依賴關系，隨著藥物濃度的增加及作用時間延長，細胞活性及增殖能力逐漸下降，見表1、表2。

2.2 姜黃素干預后細胞周期的比較

20、40、80 μmol/L姜黃素干預EC-109細胞24 h后，細胞周期各時相所占的比例不同，隨著姜黃素濃度的增大，G1/G0期所占比例對照組最低，為(51.46±3.22)%，20 μmol/L姜黃素組次之，80 μmol/L姜黃素組為(63.14±4.62)%，兩組比較有統(tǒng)計學意義(F=6.27，P<0.05)，組內(nèi)兩兩比較均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。對照組PI為(47.55±2.36)%，20、40、80 μmol/L姜黃素干預組PI分別降至(40.75±4.23)%、(31.26±3.67)% 、(22.78±2.02)%，實驗組與對照組比較均有統(tǒng)計學意義(F=12.58，P<0.01)，組內(nèi)兩兩比較均有統(tǒng)計學意義，P<0.05，見圖1，表3。

表1 姜黃素作用后細胞吸光度值比較

實驗組與對照組比較，F(xiàn)=64.95，P<0.00；相同時間組內(nèi)或相同劑量組內(nèi)兩兩比較，P<0.05

表2 姜黃素作用后細胞增殖抑制率比較

實驗組與對照組比較，F(xiàn)=71.40，P<0.00；相同時間點組內(nèi)或相同劑量組內(nèi)兩兩比較，P<0.01

表3 姜黃素作用后細胞周期變化情況

a為不同濃度姜黃作用后G0/G1期細胞數(shù)比較有統(tǒng)計學意義，F(xiàn)=6.27，P<0.05,且兩兩比較有統(tǒng)計學意義,P<0.05；b為不同濃度姜黃素作用后PI比較有統(tǒng)計學意義，F(xiàn)=12.58,P<0.01,且兩兩比較有統(tǒng)計學意義,P<0.05

圖1 3組裸鼠移植瘤剝離后的瘤體變化

2.3 姜黃素干預后cyclin D1、cyclin E變化情況

經(jīng)過Western-blot分析發(fā)現(xiàn)，20、40、80 μmol/L姜黃素分別作用EC-109細胞24 h后，β-actin蛋白表達水平無改變，cyclin D1、cyclin E表達逐漸下降，對照組蛋白條帶最寬，80 μmol/L組蛋白條帶最窄，說明姜黃素干預后，cyclin D1、cyclin E表達水平逐漸下降，見圖2。

圖2 姜黃素對EC-109細胞周期蛋白表達的影響

3 討論

腫瘤細胞具有快速無限增殖能力，抑制腫瘤細胞增殖已成為目前抗腫瘤治療的熱點之一，實驗中檢測細胞增殖采用較多的方法為MTT法[6～9]。通過MTT法我們證實，與對照組比較，作用時間相同條件下，不同濃度的姜黃素均能夠不同程度抑制食管癌EC-109細胞增殖，其抑制細胞增殖程度與姜黃素劑量呈一定的依賴關系；相同濃度情況下，隨著時間的延長，細胞增殖率亦逐漸下降。我們推斷姜黃素呈時間、劑量依賴性抑制食管癌EC-109細胞增殖。但由于MTT檢測法的局限性，我們無法說明姜黃素抑制食管癌EC-109細胞增殖的途徑。通過流式細胞儀對細胞周期各時相的檢測，我們證實，與對照組比較，不同濃度姜黃素干預食管癌EC-109細胞24 h，能夠不同程度增大細胞G0/G1期細胞比例，濃度越高，G0/G1期細胞比例越大，細胞增殖指數(shù)越小。說明姜黃素能夠通過使細胞停滯于G0/G1期，阻止細胞周期進程途徑來抑制食管癌EC-109細胞增殖。

細胞周期受控于一組被稱為細胞周期素的蛋白，它在細胞增殖分裂活動中起重要作用。哺乳動物的細胞周期蛋白有8種，表達量隨細胞周期各個時期的轉換而改變。在G1期主要有cyclin D1、cyclin E表達，是G1期進展的限速調(diào)節(jié)分子。有研究表明，cyclin D1、cyclin E表達增多，細胞由G1期進入S期進程加速，細胞增殖加速，而減少cyclin D1、cyclin E表達，能夠使細胞阻滯于G0/G1期，抑制細胞增殖[10～12]。通過Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度姜黃素分別干預食管癌EC-109細胞24 h后，cyclin D1、cyclin E表達量不同，姜黃素濃度越高，cyclin D1、cyclin E條帶越窄，說明其表達越弱。我們推斷姜黃素能夠降低EC-109細胞表達cyclin D1、cyclin E。

綜上所述，我們推斷姜黃素能夠降低食管癌EC-109細胞表達cyclin D1、cyclin E，使細胞停滯于G0/G1期，起到抑制細胞增殖作用。但細胞周期阻滯只能部分解釋姜黃素抑制食管癌EC-109細胞增殖，流式細胞儀檢測到的亞二倍體凋亡峰提示誘導凋亡也是姜黃素的作用機制之一，這也被我們前期研究證實，但姜黃素抗腫瘤作用的分子信號途徑還遠未被了解，有待今后進一步深入研究。

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