Notch1信號(hào)系統(tǒng)在氟西汀上調(diào)大鼠海馬神經(jīng)再生中的作用☆

隋毓秀 張志珺郭怡菁孫奕

近年的研究發(fā)現(xiàn)Notch1及其相關(guān)蛋白在成年動(dòng)物腦內(nèi)海馬區(qū)持續(xù)表達(dá)，表明在成熟分化的神經(jīng)系統(tǒng)中該信號(hào)通路仍然起著作用［1］。Breunig等［2］應(yīng)用原位雜交技術(shù)在體發(fā)現(xiàn)，Notch1的過度表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖。Notch1基因敲除存在小鼠海馬再生障礙，LTP下降，且可為外源性Jag-1逆轉(zhuǎn)［3］。由此可見，Notch1信號(hào)系統(tǒng)對(duì)成年期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生有重要作用。我們前期的研究通過慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)和孤養(yǎng)法建立抑郁大鼠模型，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，抑郁大鼠海馬齒狀回Notch1信號(hào)通路蛋白及基因表達(dá)水平顯著降低，與同一部位的神經(jīng)干細(xì)胞增殖的減少并行［4］。提示Notch1信號(hào)通路有可能在抑郁大鼠神經(jīng)重塑障礙發(fā)揮作用。而氟西汀促進(jìn)神經(jīng)再生與其抗抑郁效應(yīng)相關(guān)。這些促使我們思考，慢性氟西汀干預(yù)提高神經(jīng)再生是否同樣伴隨著Notch1信號(hào)通路的改變。為了說明這一問題，我們應(yīng)用大鼠腹腔注射氟西汀建立在體模型，測(cè)定大鼠海馬中BrdU陽性細(xì)胞數(shù)和Notch1信號(hào)通路各個(gè)因子的基因及蛋白表達(dá)水平的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley(SD)成年雄性大鼠，體質(zhì)量在220～280 g之間。腹腔注射氟西汀(Fluoxetine，F(xiàn)lu)建立干預(yù)模型。選擇體重相近大鼠約40只，每組12只，隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、14 d Flu干預(yù)組、28 d Flu干預(yù)組。干預(yù)組給予氟西汀(常州四藥)，蒸餾水配成質(zhì)量濃度1 mL/mg的溶液，2 mg/kg，每日1次腹腔注射，對(duì)照組同時(shí)給予同等量生理鹽水，治療持續(xù)至14 d或28 d結(jié)束［5］。干預(yù)組和對(duì)照組大鼠每籠5只，在相同的室溫、光照條件下正常喂養(yǎng)，給藥時(shí)間為每日下午14:00。

將BrdU用生理鹽水配制成5 mg/mL的溶液，在應(yīng)激開始和最后1 d分別腹腔注射(3×50 mg/kg;每8 h)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化和免疫熒光檢測(cè)海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖、存活和分化 BrdU注射后2 h，戊巴比妥鈉深度麻醉大鼠。多聚甲醛PBS溶液灌注、固定、取腦，海馬連續(xù)冰凍切片，片厚30 μm。BrdU免疫組化:小鼠抗大鼠BrdU抗體(1∶500)，生物素化的羊抗小鼠IgG(1∶500)，辣根過氧化物酶復(fù)合物(1:100)，DAB顯色劑呈色，封片、鏡檢。BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標(biāo):小鼠抗大鼠 BrdU抗體(1∶200)，山羊抗小鼠 TRITC(1∶200)，兔抗 NeuN 抗體(1∶200)或兔抗 GFAP 抗體(1∶200)，山羊抗兔 FITC(1∶200)。

用Nikon CFM-500 E倒置熒光顯微鏡和圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察與分析。采用盲法立體計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)海馬齒狀回的BrdU陽性細(xì)胞總數(shù)。每只大鼠每隔6張選取1張腦片，對(duì)海馬齒狀回，計(jì)數(shù)兩條顆粒細(xì)胞層的內(nèi)側(cè)邊界和門區(qū)的BrdU陽性細(xì)胞。在400倍和1000倍的光鏡下計(jì)數(shù)，視野最邊界的細(xì)胞不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。計(jì)數(shù)每張腦切片BrdU陽性細(xì)胞數(shù)，相加后乘以6即得到每個(gè)大鼠海馬齒狀回的總BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目(n=6)。免疫熒光:每只大鼠統(tǒng)計(jì)不少于50個(gè)BrdU陽性細(xì)胞，以雙標(biāo)陽性占全部BrdU細(xì)胞的比例×100來表示(n=6)。

1.2.2 Real time PCR 和 Western blot檢測(cè) Notch1 信號(hào)系統(tǒng)各因子基因表達(dá)和蛋白水平 應(yīng)激結(jié)束后第2天斷頭處死大鼠，快速剝離海馬，機(jī)械勻漿后置于－80℃中保存?zhèn)溆?。用Triziol法提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。構(gòu)建聚合酶體系(詳見表1)。Taq酶(Promega)催化。熱循環(huán):95℃預(yù)熱5 min，35個(gè)循環(huán)(95℃ 10 s;57℃ 15 s;72℃ 20 s;85℃5 s)。各樣品目的基因和管家基因分別進(jìn)行SYBR熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)，檢測(cè)Notch通路相關(guān)因子基因表達(dá)水平，各實(shí)驗(yàn)組均取同樣條件下培養(yǎng)的3份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，取其平均值，結(jié)果表示為由梯度稀釋DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品目的基因校正后的相對(duì)含量(目的基因與內(nèi)參比值)±標(biāo)準(zhǔn)差。

海馬組織經(jīng)蛋白質(zhì)抽提試劑(1 mL抽提試劑中加入5 μL 蛋白酶抑制劑混合液，5 μL PMS F 和 5 μL 磷酸酶混合液)提取蛋白質(zhì)?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)變性取50 μg經(jīng)20%SDS-PAGE(十二烷基硫磺胺－聚丙烯酰胺)電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF(聚偏二氟乙烯)，4℃封閉過夜，用一抗(rabbit anti-NICD，Hes1，Hes5，Jag1 and Beta-actin antibody，1 ∶1000，Santa Cruz)室溫孵育1 h，洗膜后加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(anti-rabbit IgG conjugated to horseradish peroxidase，HRP，1∶5000，Santa Cruz)。ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法)顯影，x光片暗室中感光，凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能儀器有限公司)進(jìn)行掃描并記錄光密度強(qiáng)度。蛋白水平結(jié)果以相對(duì)灰度值表示，即目的基因與內(nèi)參(βactin)灰度測(cè)量比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)均以±s表示。采用單因素方差(one-way ANOVA)分析進(jìn)行顯性檢驗(yàn)，組間差異比較用Bonferroni法，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

表1 Notch通路各因子引物序列

2 結(jié)果

2.1 慢性氟西汀干預(yù)對(duì)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖、存活和分化的影響

2.1.1 神經(jīng)干細(xì)胞的增殖 在氟西汀干預(yù)最后一天大鼠腹腔注射BrdU，以觀察氟西汀對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。如圖1所示，BrdU陽性細(xì)胞主要位于亞顆粒細(xì)胞層，呈簇狀，形狀不一，提示正在進(jìn)行分裂的不成熟細(xì)胞［5］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(2919.50±188.80)比較，F(xiàn)lu干預(yù)14 d組(3706.50±228.04)和Flu干預(yù)28 d(4334.33±217.48)組海馬BrdU陽性細(xì)胞明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

2.1.2 神經(jīng)干細(xì)胞的存活 在氟西汀干預(yù)開始大鼠腹腔注射BrdU，以觀察氟西汀對(duì)海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活和分化的影響。如圖2所示，BrdU陽性細(xì)胞形狀較為規(guī)整，呈園形或橢圓形，且BrdU陽性細(xì)胞的絕對(duì)值較觀察增殖狀態(tài)時(shí)少，提示經(jīng)4周生長、成熟，部分干細(xì)胞可能已凋亡，與既往研究結(jié)果一致［6］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(2404.50±148.77)相比，F(xiàn)lu干預(yù) 28 d組(3273.16±156.68)BrdU陽性細(xì)胞明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

2.1.3 神經(jīng)干細(xì)胞的分化 神經(jīng)干細(xì)胞分化成為成熟的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞至少需28 d，因此我們氟西汀干預(yù)開始時(shí)大鼠腹腔注射BrdU(3×50 mg/kg;每8 h)，以觀察其分化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(71.63±10.21)相比，F(xiàn)lu干預(yù)28 d組(72.41±13.34)NeuN/BrdU比例無明顯差異(P＞0.05);與對(duì)照組(14.34±2.03)相比，F(xiàn)lu干預(yù)28 d組(18.21±2.60)GFAP/BrdU比例無明顯差異(P＞0.05)。(圖3)

2.2 慢性氟西汀干預(yù)對(duì)Notch1信號(hào)系統(tǒng)各因子基因表達(dá)和蛋白水平的影響

2.2.1 Real time PCR檢測(cè)Notch1信號(hào)通路各因子基因表達(dá) 如圖4所示，與對(duì)照組［NICDmRNA(0.30±0.03)，Hes1mRNA(0.53 ±0.03)，Hes5mRNA(0.21 ±0.02)，Jag1mRNA(1.04±0.07)］比較，F(xiàn)lu干預(yù) 14 d組［NICDmRNA(0.45±0.05)，Hes1mRNA(0.65±0.06)，Hes5mRNA(0.31 ±0.06)，Jag1mRNA(2.46 ±0.39)］和 Flu干預(yù) 28 d［NICDmRNA(0.42±0.03)，Hes1mRNA(0.85±0.06)，Hes5mRNA(0.39±0.02)，Jag1mRNA(3.21±0.34)］組Notch1信號(hào)通路各因子基因水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P ＜0.001)。

2.2.2 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) (Western blotting)檢測(cè)Notch1信號(hào)通路各因子(NICD、Hes1、Hes5、Jagged1)蛋白水平 如圖5所示，與對(duì)照組［NICD(2.36±0.17)，Jag1(2.33±0.31)］比較，F(xiàn)lu干預(yù) 14d組［NICD(3.20±0.25)，Jag1(2.86±0.25)］和 Flu干預(yù)28 d［NICD(3.40±0.19)，Jag1(3.35±0.14)］組Notch1信號(hào)通路蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.001)。與對(duì)照組Hes5(0.89±0.20)比較，F(xiàn)lu干預(yù)14 d組 Hes5(0.95±0.09)和 Flu干預(yù)28 d Hes5(1.14±0.09)蛋白水平無改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與對(duì)照組Hes1(1.09±0.25)比較，F(xiàn)lu干預(yù)14 d組Hes1(1.32±0.22)蛋白水平無顯著改變(P＞0.05)，F(xiàn)lu干預(yù)28 d Hes1(1.43±0.13)蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 慢性Flu干預(yù)對(duì)海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。A、B、C分別顯示對(duì)照組、Flu干預(yù)14 d組和Flu干預(yù)28 d組海馬BrdU陽性細(xì)胞(10×)

圖2 慢性Flu干預(yù)對(duì)海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞存活的影響。A、B分別顯示經(jīng)過28 d Flu干預(yù)后，對(duì)照組、Flu干預(yù)28d組海馬的存活細(xì)胞(10×)

圖3 海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的分化(BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標(biāo))(20×)

圖4 Real time PCR檢測(cè)慢性Flu干預(yù)后Notch1信號(hào)通路各因子基因表達(dá)，與對(duì)照組比較，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001

圖5 Western blot檢測(cè)慢性Flu干預(yù)后Notch1信號(hào)通路各因子蛋白水平。A:蛋白表達(dá)圖片，B:各因子蛋白水平;與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001

3 討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用BrdU觀察慢性氟西汀干預(yù)對(duì)正常大鼠海馬齒狀回神經(jīng)再生的影響。在連續(xù)給藥14 d或28 d后，大鼠腹腔注射BrdU標(biāo)記，行免疫組織化學(xué)染色。圖1顯示，氟西汀干預(yù)下海馬BrdU陽性細(xì)胞進(jìn)行性增加，說明慢性氟西汀干預(yù)增加神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，且隨用藥時(shí)間的延長，促增殖作用愈加明顯。BrdU注射28 d以后，行免疫組化染色觀察新生細(xì)胞的存活。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)lu28 d組BrdU陽性細(xì)胞顯著增加。說明慢性氟西汀具有保護(hù)神經(jīng)干細(xì)胞抗凋亡的作用，增加了神經(jīng)干細(xì)胞的存活。應(yīng)用成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，同時(shí)與BrdU免疫熒光雙標(biāo)顯示神經(jīng)干細(xì)胞的分化。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)慢性氟西汀干預(yù)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，慢性(2～4周)氟西汀干預(yù)可以促進(jìn)齒狀回的神經(jīng)發(fā)生，引起正常大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活的上調(diào)，而對(duì)分化無明顯影響。提示氟西汀的神經(jīng)保護(hù)作用是確切的，與臨床起效時(shí)間一致，而且宜長期用藥以確保能全面發(fā)揮保護(hù)功效。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，長期(2～4周)氟西汀處理增加BrdU陽性細(xì)胞比例是通過促進(jìn)細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的，對(duì)細(xì)胞分化沒有任何影響［7－8］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次驗(yàn)證了這一現(xiàn)象。

氟西汀能促進(jìn)成年動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和存活，一定程度上改善應(yīng)激造成的神經(jīng)功能缺損［9］，但至今對(duì)其內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖的分子機(jī)制不甚了解。本研究以慢性氟西汀干預(yù)正常大鼠作為研究對(duì)象，選擇在用藥后14 d和28 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)海馬Notch通路各因子的表達(dá)，以闡明整個(gè)通路的功能狀態(tài)。結(jié)果提示慢性氟西汀干預(yù)大鼠海馬的Notch1信號(hào)通路呈現(xiàn)進(jìn)行性表達(dá)變化，即干預(yù)后14 d和28 d Notch信號(hào)各因子基因表達(dá)均顯著增高。提示氟西汀干預(yù)狀態(tài)下Notch信號(hào)通路功能的上調(diào)。而在蛋白水平，干預(yù)后14 d和28 d僅發(fā)現(xiàn)NICD和Jag1的顯著升高，Hes1在氟西汀干預(yù)28 d后有顯著升高，Hes5無明顯改變，個(gè)別因子變化的不同步性可能與蛋白表達(dá)的延遲有關(guān)。而配體和受體表達(dá)的升高仍可說明該信號(hào)通路的激活。

對(duì)Notch通路的研究顯示，Notch信號(hào)具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、維持和向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的作用。NICD是Notch通路的胞內(nèi)活性片段，代表信號(hào)系統(tǒng)的激活，該因子的表達(dá)增加強(qiáng)有力的提示通路功能的上調(diào)。Hes1、Hes5作為Notch信號(hào)途徑的靶基因，較之其它因子(如Hes-3)，與維持神經(jīng)干細(xì)胞在未分化狀態(tài)的聯(lián)系更為緊密。并且發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育中HES-5可以作為特定標(biāo)記物來區(qū)分神經(jīng)干細(xì)胞與其它祖細(xì)胞［10］。因而，Hes1和Hes5的表達(dá)增加，與促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖有密切關(guān)系。研究表明，Jag1可通過作用于Notch受體和其下游效應(yīng)器(信號(hào)分子Shh等)來促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的生存1［11－13］。Jag1的表達(dá)增加，可能通過Shh發(fā)揮其促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用。Notch信號(hào)通路的激活促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和存活，與此一致，我們?cè)诿庖呓M化中試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨氟西汀干預(yù)時(shí)間的持續(xù)，神經(jīng)干細(xì)胞增殖和存活的數(shù)目進(jìn)行性增加，提示Notch參與了氟西汀調(diào)節(jié)海馬齒狀回神經(jīng)再生的上調(diào)。但本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞分化的增多，提示還有其他調(diào)控因子參與了海馬神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，慢性氟西汀干預(yù)下Notch1信號(hào)通路功能上調(diào)的同時(shí)，海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、存活增加。二者發(fā)生的一致性，結(jié)合近年來有關(guān)Notch信號(hào)通路在成年后神經(jīng)再生作用的研究背景，提示Notch1信號(hào)系統(tǒng)可能與氟西汀干預(yù)下海馬的神經(jīng)重塑障礙有關(guān)。我們將在進(jìn)一步的研究中檢測(cè)氟西汀干預(yù)應(yīng)激大鼠后Notch通路的功能狀態(tài)，研究其與海馬神經(jīng)再生的關(guān)系，這將有助于進(jìn)一步闡明抑郁狀態(tài)下神經(jīng)增殖、分化的基本機(jī)制，尋找到新的抗抑郁治療的靶點(diǎn)。

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