?；撬釋?duì)腎NRK-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)及初步機(jī)制

龔 慧，萬慧芳，王美鳳，涂 碩，余樂涵，楊曉紅，萬福生

(1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西南昌 330006;2.南昌市第一醫(yī)院護(hù)理部，江西南昌 330008)

?；撬?taurine，Tau)在生物體內(nèi)參與一系列的生理學(xué)過程，如與膽汁酸結(jié)合、調(diào)節(jié)滲透壓、細(xì)胞鈣流動(dòng)調(diào)節(jié)、抗氧化和抗心律失常等［1－3］。研究表明［2－3］，Tau 可下調(diào)缺血/再灌注(I/R)心肌和肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GRP78、減少細(xì)胞凋亡。研究也表明［4］，Tau對(duì)大鼠急性腎小管壞死、膜性腎病、糖尿病腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化等多種腎臟病具有防治作用，其確切機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)擬在建立腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧 (H/R)模型上，觀察Tau對(duì)NRK-52E細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用及其初步機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與分組大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK-52E細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、H/R組和H/R+Tau組，具體操作如下:① 正常對(duì)照組:正常培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞。②H/R組:取缺氧8 h/復(fù)氧12 h(以Caspase-12活性最強(qiáng)而定)。③ H/R+Tau組:于培養(yǎng)基中加入?；撬嵋?終濃度為10、20、40、80 mmol·L－1)，余操作同 H/R 組。

1.2NRK-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立從液氮罐中取出凍存的NRK-52E細(xì)胞投入37℃的水浴箱中，充分搖動(dòng)使其盡快解凍，復(fù)蘇。吸出細(xì)胞懸液并滴加10倍體積的含10%(V/V)新生牛血清的高糖 DMEM 培養(yǎng)基，混勻，1 000 r·min－1離心 5 min，棄上清液后再重復(fù)洗滌1次。用含10%牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋混勻，接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，37℃下置入體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置12 h，換液除去未貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞匯合80%后換成無血清的高糖DMEM進(jìn)行同步化培養(yǎng)24 h，而后將培養(yǎng)瓶置于含95%N2-5%CO2(V/V)混合氣體的密閉容器中(37℃)進(jìn)行缺氧孵育8 h，再進(jìn)行復(fù)氧孵育12 h。

1.3臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及檢測(cè)細(xì)胞存活率制備單個(gè)細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋(109·L－1)。染色:取9滴細(xì)胞懸液移入小試管中，加1滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻。計(jì)數(shù):在3 min內(nèi)，用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。根據(jù)下式求細(xì)胞存活率/%。

1.4分析GRP78、Caspase-12和Caspase-3的mRNA表達(dá)采用TRIzol法提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后得cDNA，進(jìn)行PCR。各取 cDNA產(chǎn)物2 μl，待測(cè)GAPDH 和 GRP78、Caspase-12、Caspase-3 的正、反義引物(見 Tab 1)各 1 μl(10 μmol·L－1)，2 × Taq PCR Master Mix 8.5 μl，ddH2O 12.5 μl，總反應(yīng)體積25 μl。反應(yīng)條件:94℃ 3 min;94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);結(jié)束前72℃延伸10 min。分別取PCR產(chǎn)物6 μl，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，計(jì)算并比較各組目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 RT-PCR primer sequences and fragment

1.5檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞GRP78、Caspase-12、Caspase-3蛋白的表達(dá)經(jīng)離心收集培養(yǎng)細(xì)胞，用預(yù)冷PBS漂洗2次，加入含PMSF裂解液400 μl，冰上裂解30 min;然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 EP管中，離心(12 000×g，4℃)5 min，上清轉(zhuǎn)移至另一 EP管中。取上清50 μl加入2×蛋白提取Loading buffer 40 μl和 10 μl DTT，煮沸 10 min，取 8 μl上樣，進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(12%分離膠和5%積層膠)電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;在含5%脫脂奶粉的TBST中緩慢振蕩過夜，分別加入抗β-actin兔抗大鼠多克隆抗體(1∶5 000)、抗GRP78兔抗大鼠多克隆抗體(1∶500)、Caspase-12兔抗大鼠多克隆抗體(1∶1 000)和Caspase-3兔抗大鼠多克隆抗體(1∶500)等一抗，室溫緩慢振蕩2 h后，加入結(jié)合緩沖液稀釋的二抗，曝光、顯影并定影，半定量分析。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡率采用Annexin V-FITC和PI聯(lián)合染色的流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。0.25%胰蛋白酶消化收集腎小管上皮細(xì)胞。用500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞后，加入FITC 標(biāo)記的Annexin-V(40 mg·L－1)和PI(50 mg·L－1)各5 μl，避光反應(yīng) 5 min。用 FACScan 檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡水平。設(shè)正常細(xì)胞且不加Annexin V-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照組。

1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度用0.25%的胰酶消化并收集細(xì)胞。鈣敏感熒光探針采用Fluo-3/AM，向收集的細(xì)胞中加入終濃度為 1 μmol·L－1的 Fluo-3/AM。振蕩混勻，37℃避光孵育45 min，再用PBS洗滌2遍，去除未結(jié)合的染料。再孵育15 min后送流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)luo-3/AM的激發(fā)光488 nm，吸收光526 nm，共計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，使用熒光強(qiáng)度來反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果用±s表示，統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1各組NRK-52E細(xì)胞存活率情況對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞存活率的比較(見Tab 2)。細(xì)胞給予缺氧/復(fù)氧刺激后其生長(zhǎng)增值較正常對(duì)照組減慢，?；撬崽幚斫M除10 mmol·L－1濃度組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P＞0.05)，其余濃度組情況均優(yōu)于H/R組(均P＜0.01)。

Tab 2 Cell count and survival rate in each group(±s，n=6)

Tab 2 Cell count and survival rate in each group(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R

Group Cell count/106·L－1Cell survival rate/%Control 6.36 ±0.91 96.79 ±2.31 H/R 3.40 ±0.50＊＊ 52.21 ±6.84＊＊Tau 10 mmol·L－1 3.68 ±0.43＊＊ 56.42 ±6.37＊＊Tau 20 mmol·L－1 4.12 ±0.49＊＊# 63.40 ±8.94＊＊##Tau 40 mmol·L－1 4.89 ±0.78＊＊## 74.49 ±6.76＊＊##Tau 80 mmol·L－1 5.20 ±0.81＊＊## 79.36 ±7.03＊＊##

2.2NRK-52E細(xì)胞GRP78、Caspase-12和Caspase-3 mRNA表達(dá)變化RT-PCR電泳結(jié)果顯示，除80 mmol·L－1?；撬峤M外，各濃度?；撬崽幚斫MGRP78/GAPDH、Caspase-12/GAPDH和Caspase-3/GAPDH光密度值之比與正常對(duì)照組相比亦有增高(P＜0.01)，且隨著?；撬峤K濃度的增加而呈逐漸降低的趨勢(shì)(Fig 1)，但均明顯低于H/R組(P＜0.05)。

Fig 1 mRNA expression of GRP78，Caspase-12 and Caspase-3 in NRK-52E cells

2.3NRK-52E細(xì)胞GRP78、Caspase-12及Caspase-3蛋白表達(dá)變化Western blot方法檢測(cè)各組NRK-52E細(xì)胞 GRP78、Caspase-12及 Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示(Fig 2)，與正常對(duì)照組相比，H/R組和各濃度?；撬崽幚斫M的 GRP78、Caspase-12及Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯增高(P＜0.01);但牛磺酸處理組GRP78、Caspase-12及Caspase-3蛋白表達(dá)量均低于H/R組，差異具有顯著性(P＜0.01)。

Fig 2 Protein expression of GRP78，Caspase-12 and Caspase-3 in NRK-52E cells

2.4各組NRK-52E細(xì)胞Caspase-3活性和凋亡率經(jīng)熒光分析測(cè)得H/R組(2.88±0.19)NRK-52E細(xì)胞Caspase-3活性是對(duì)照組(0.31±0.06)的9.3倍(P＜0.01);各濃度?；撬崽幚斫M的Caspase-3活性為(1.23±0.16)、(0.95±0.09)、(0.75±0.08)和(0.48±0.06)，與 H/R組比較均降低(P＜0.01)，且有劑量依賴性。表明?；撬釋?duì)H/R損傷NRK-52E細(xì)胞的Caspase-3活化升高有較好的抑制作用。

Annexin-V/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，H/R組凋亡程度明顯增加(P＜0.01);與H/R組比較，?；撬崽幚斫M細(xì)胞凋亡率明顯降低，除10 mmol·L－1濃度組外，凋亡率與H/R組相比差異有顯著性(P＜0.01)。表明?；撬峥蓽p少由缺氧/復(fù)氧引起的NRK-52E細(xì)胞凋亡并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(Fig 3)。

2.5NRK-52E細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的變化流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示NRK-52E細(xì)胞H/R后平均胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度值明顯升高(P＜0.01)，與H/R組相比，牛磺酸處理后平均胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度值下降(P＜0.05)，且隨?；撬峤K濃度的增加，平均胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度值有逐漸降低的趨勢(shì)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(Fig 4)。

Fig 3 The change of apoptotic rate in NRK-52E cells by flow cytometry

Fig 4 The fluorescence intensity of intracellular Ca2+in NRK-52E cells

3 討論

大量研究表明［5－7］，腎缺血/再灌注誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)反應(yīng)。ERS是誘導(dǎo)心肌和腎臟等重要臟器細(xì)胞損傷的重要因素［8－9］，Bando 等［10］發(fā)現(xiàn)急性腎衰患者的腎組織出現(xiàn)ERS，在低氧狀態(tài)下培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞也出現(xiàn)ERS。Hao等［11］和 Montie 等［12］發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧可觸發(fā) ERS，包括誘導(dǎo) GRP94、CHOP表達(dá)，激活Caspase-12，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NRK-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧刺激后，ERS蛋白GRP78表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞凋亡率增加。說明ERS參與了大鼠腎小管上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。近年來研究證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞凋亡在腎缺血/再灌注損傷過程中起關(guān)鍵作用［13］，激活腎小球和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的途徑包括存活因子的缺失、死亡受體激活、線粒體損傷、溶酶體失穩(wěn)態(tài)和ERS等［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:NRK-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧刺激后，ERS標(biāo)志性蛋白GRP78和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性凋亡誘導(dǎo)蛋白Caspase-12升高，表明腎小管上皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并活化Caspase-12來觸發(fā)凋亡。?；撬崽幚斫M NRK-52E細(xì)胞 GRP78、Caspase-12和Caspase-3表達(dá)及細(xì)胞凋亡率均下降。提示?；撬崮芤种迫毖?復(fù)氧刺激引起NRK-52E細(xì)胞凋亡，其部分機(jī)制是通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Caspase-12凋亡信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。

有研究認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在維持胞內(nèi)游離Ca2+穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。靜息狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+濃度比胞質(zhì)高得多，維持這一外低內(nèi)高的Ca2+梯度和Ca2+穩(wěn)態(tài)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上3種與Ca2+的攝入和釋放相關(guān)的通道［15］，分別是將Ca2+從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+泵(Ca2+ATPase)或肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+泵(SERCA)以及向胞質(zhì)內(nèi)釋放 Ca2+的 1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)和藍(lán)尼叮受體(ryanodine receptor，RyR)。為進(jìn)一步深入研究Tau在調(diào)節(jié)缺氧/復(fù)氧刺激后NRK-52E細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的作用，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了NRK-52E細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H/R組平均胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度值較對(duì)照組有明顯升高(P＜0.01);與H/R組相比，?；撬崽幚斫M平均胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度下降(P＜0.05)，且呈一定的劑量依賴性，說明牛磺酸具有減少細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，抑制鈣超載的作用?？傊?，本文結(jié)果表明，牛磺酸對(duì)腎小管上皮NRK-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷具有較好的抑制作用，且呈一定劑量依賴性，其機(jī)制主要是降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78和 Caspase-12、Caspase-3的表達(dá)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，減少細(xì)胞凋亡，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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