鉤藤生物堿對自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈平滑肌細胞凋亡和增殖的影響

孫敬昌，齊冬梅，周洪雷，李運倫

(1.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南 250355;2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011)

中藥材鉤藤含有鉤藤堿、異鉤藤堿、柯諾辛堿、異柯諾辛堿、柯楠因堿和二氫柯楠因堿等30余種生物堿，其中鉤藤堿和異鉤藤堿是其發(fā)揮降壓效應的主要成分。前期研究表明鉤藤堿和異鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激所誘導血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和凋亡均有干預效應［1－2］，并能降低自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)胸主動脈和腸系膜動脈中膜厚度/管腔直徑比值，改善胸主動脈和腸系膜動脈病理組織學損害［3］，但能否影響SHR胸主動脈中膜平滑肌細胞的凋亡和增殖尚不清楚。本文研究鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿對SHR胸主動脈平滑肌細胞凋亡率、凋亡平滑肌細胞mRNA表達、Bcl-2、Bax、c-fos、c-myc 蛋白表達和 PDGF-B mRNA 表達的影響，初步探討其干預SHR胸主動脈平滑肌細胞增殖和凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物♂SHR 40只，8周齡，體質(zhì)量192～217 g，由北京市維通利華實驗動物中心提供〔許可證:SCXK(京)2002-0003〕;♂ Wistar大鼠8只，8周齡，體質(zhì)量195～225g，山東大學實驗動物中心提供〔許可證:SCXL(魯)20030004〕。

1.2試劑與材料鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿:由山東中醫(yī)藥大學藥學院周洪雷教授提供，純度分別為99.7%、99.7%和80%，用前經(jīng)0.1 mol·L－1HCl溶解后，分別用蒸餾水稀釋為5、0.5和0.5 mg·L－1，調(diào)pH至7.2。置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用前振蕩，充分搖勻?？ㄍ衅绽?濟南東風制藥有限公司，魯藥準字(2001)第 027510號，生產(chǎn)批號:0208023，25 mg/片。實驗前加生理鹽水適量，配制成1.75 g·L－1的混懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。即用型SABC免疫組化檢測試劑盒、親和純化c-myc鼠單抗IgG、親和純化c-fos兔多抗 IgG、親和純化Bax鼠單抗IgG、親和純化Bcl-2鼠單抗IgG、DAB顯色劑、生物素化山羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司;PDGF-B原位雜交檢測試劑盒、細胞凋亡原位雜交檢測試劑盒，北京中杉金橋生物制品有限公司產(chǎn)品;Annexin V-FITC apoptosis detection kit，美國BD Pharmingen公司產(chǎn)品。

1.3動物分組給藥將SHR隨機分為5組:模型組、卡托普利組、異鉤藤堿組、鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組。Wistar大鼠8只作為正常組。卡托普利組給藥量為每天17.5 mg·kg－1，異鉤藤堿組、鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組的給藥量分別為每天5、5和50 mg·kg－1，模型組和正常組給予等容量生理鹽水。給藥容積為每次10 ml·kg－1，灌胃給藥，每周給藥6 d，每天下午定時給藥，連續(xù)8周，并隨體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。

1.4動脈留取末次用藥后24 h禁食不禁水12 h，用2%戊巴比妥鈉2ml·kg－1體質(zhì)量腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血。取血后立即從頸靜脈穿刺插管，用4℃生理鹽水約50 ml快速灌注沖洗，待沖洗液無色后，快速分離、摘取胸主動脈，剝離血管外膜，刮去血管內(nèi)膜，分為3份:1份作凋亡率檢測;1份10%甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測;1份4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于原位雜交檢測。

1.5胸主動脈平滑肌細胞凋亡檢測采用Annexin V-FITC結(jié)合PI染色、流式細胞術(shù)分析細胞凋亡率的方法。將胸主動脈中膜在4℃生理鹽水中剪成約1 mm3小塊，0.4%胰酶溶液 37℃消化 1 h，加DMEM終止消化，過100目濾網(wǎng)，800 r·min－1離心5 min，4℃ PBS液漂洗2次，用1×Binding buffer將洗過的細胞懸起，使成約1×109cells·L－1，取100 μl細胞懸液，加 5μl AnnexinV-FITC 和 10 μl PI溶液，輕輕混勻，暗處放置 15 min，加 400 μl 1 × Binding buffer，輕輕混勻，過300目濾網(wǎng)，上機分析。以Annexin V+/PI－為凋亡細胞。

1.6胸主動脈凋亡平滑肌細胞mRNA及PDGF mRNA表達檢測采用原位雜交法，嚴格按照試劑盒說明進行操作。并用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件對結(jié)果進行半定量分析，測定平均灰度，以此作為該樣本凋亡平滑肌細胞的mRNA和PDGF mRNA的相對表達量。

1.7胸主動脈Bcl-2、Bax、c-myc和c-fos蛋白表達檢測采用免疫組織化學SABC法:石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫10 min，PBS洗5 min×3次，微波修復抗原，5%BSA封閉20 min，滴加親和純化Bcl-2或Bax鼠單抗IgG(1∶100倍稀釋)，濕盒內(nèi)37℃ 1 h，PBS代替一抗作為陰性對照，PBS洗2 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔 IgG，37℃ 20 min，PBS洗2 min×3次，滴加試劑 SABC，37℃ 20 min，PBS洗5 min×4次，DAB顯色，鏡下控制時間，蒸餾水洗滌，脫水，透明，中性樹膠封片。任選5個視野用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)9.0測定積分光密度，以均值作為該樣本Bcl-2、Bax的相對表達量。

1.8統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以±s表示，應用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1對SHR胸主動脈平滑肌細胞凋亡率的影響如Tab 1示，與模型組相比，鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組大鼠胸主動脈平滑肌細胞凋亡率均增高(P＜0.05)。

Tab 1 Comparison of thoracic aorta smooth muscle cell apoptosis in each group(±s，n=8)

Tab 1 Comparison of thoracic aorta smooth muscle cell apoptosis in each group(±s，n=8)

*P＜0.05 vs model

Group Apoptotic rate/%Normal 5.823 ±1.775 Model 6.133 ±2.990 Captopril 6.680 ±1.092 Rhynchophylline 8.080 ±1.393*Isorhynchophylline 7.265 ±1.944*Uncaria alkaloids 8.215 ±3.169*

2.2胸主動脈PDGF mRNA及凋亡平滑肌細胞mRNA表達如Tab 2所示，與模型組相比，鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組大鼠胸主動脈凋亡平滑肌細胞mRNA表達均增高(P＜0.05)，其中尤以異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組升高為明顯(P＜0.01)。與模型組相比，鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組大鼠胸主動脈平滑肌細胞PDGF mRNA表達明顯降低(P＜0.05)。

Tab 2 Comparison of the mRNA expression of thoracic aorta smooth muscle cell apoptosis in each group(±s，n=8)

Tab 2 Comparison of the mRNA expression of thoracic aorta smooth muscle cell apoptosis in each group(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Apoptotic smooth muscle cell mRNA PDGF-B mRNA Normal 0.161 ±0.022 0.358 ±0.011 Model 0.222 ±0.021 0.412 ±0.011 Captopril 0.292 ±0.012＊＊ 0.409 ±0.004 Rhynchophylline 0.272 ±0.010* 0.378 ±0.013*Isorhynchophylline 0.289 ±0.023＊＊ 0.380 ±0.009*Uncaria alkaloids 0.283 ±0.005＊＊ 0.388 ±0.011*

2.3對胸主動脈Bcl-2和Bax蛋白表達的影響如Tab 3示，與模型組相比，異鉤藤堿組大鼠胸主動脈平滑肌細胞Bcl-2蛋白表達明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比，鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組大鼠胸主動脈平滑肌細胞Bax蛋白表達均升高(P＜0.01)。

Tab 3 Comparison of the thoracic aorta protein expression of Bc1-2 and Bax in each group(±s，n=8)

Tab 3 Comparison of the thoracic aorta protein expression of Bc1-2 and Bax in each group(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Bcl-2 Bax Normal 35.9 ±10.4 24.6 ±4.3 Model 74.2 ±12.5 34.6 ±5.4 Captopril 69.2 ±10.2 44.6 ±6.6＊＊Rhynchophylline 62.1 ±8.5 48.7 ±6.7＊＊Isorhynchophylline 59.2 ±11.2* 63.2 ±7.3＊＊Uncaria alkaloids 63.2 ±8.3 57.8 ±6.2＊＊

2.4對胸主動脈c-fos、c-myc蛋白表達的影響如Tab 4示，與模型組相比，鉤藤堿組、異鉤藤堿組和鉤藤總生物堿組大鼠胸主動脈平滑肌細胞c-fos蛋白和c-myc蛋白表達降低(P＜0.05)。

Tab 4 Comparison of the thoracic aorta protein c-fos and c-myc expression in each group(±s，n=8)

Tab 4 Comparison of the thoracic aorta protein c-fos and c-myc expression in each group(±s，n=8)

*P＜0.05 vs model

Group c-fos c-myc Normal 114.0 ±10.8 21.2 ±10.1 Model 216.5 ±15.5 72.3 ±13.9 Captopril 146.1 ±8.9* 53.6 ±11.5*Rhynchophylline 126.4 ±7.5* 57.1 ±12.5*Isorhynchophylline 132.5 ±7.7* 34.3 ±17.8*Uncaria alkaloids 136.9 ±12.4* 42.9 ±2.8*

3 討論

血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖與凋亡是維持血管壁細胞數(shù)量相對恒定的一對基本因素，是血管重塑的細胞學基礎(chǔ)。在高血壓的病理進程中，VSMC的凋亡同增殖相伴行，正由于MSMC過度增殖、凋亡不足、增殖與凋亡之間的動態(tài)平衡被打破，導致血管壁異常增殖［4－5］。所以，在抑制VSMC增殖的同時，誘導VSMC凋亡不僅是抗血管重塑的基本策略，同時也是研制新型抗高血壓藥物的基本目標。

細胞凋亡是重要的生命現(xiàn)象之一，對于除去多余的有害或衰老細胞，調(diào)節(jié)細胞數(shù)量及維持組織構(gòu)型具有重要意義。體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs及高血壓血管重塑的 VSMC都存在細胞凋亡現(xiàn)象［6－7］。VSMC發(fā)生過度凋亡是其由分化表型向去分化表型轉(zhuǎn)化過程的一個重要病理特征，與VSMC異常增殖及成熟抑制狀態(tài)相關(guān)［8］，進一步的機制與上調(diào)Bax表達、caspase-3的激活及下調(diào) Bcl-2的表達有關(guān)［9－10］。研究結(jié)果顯示經(jīng)鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿干預后，SHR胸主動脈平滑肌細胞凋亡率及凋亡平滑肌細胞mRNA表達均增多，表明鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿對SHR胸主動脈平滑肌細胞凋亡有誘導作用。

線粒體途徑是最重要的細胞凋亡信號途徑之一，Bcl-2家族蛋白是該途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，對調(diào)控細胞凋亡有重要作用。Bax和Bcl-2是該家族中最重要成員，是一對正負凋亡調(diào)節(jié)基因，Bcl-2基因是哺乳動物重要的凋亡抑制基因，Bax是與Bcl-2功能相反的一個基因，促進細胞凋亡［11］。Bax的同源二聚體促進凋亡，Bcl-2的同源二聚體抑制細胞凋亡，Bax和Bcl-2形成的異源二聚體對凋亡無作用，Bcl-2高于Bax，Bcl-2的同源二聚體增多，細胞趨于存活，反之則細胞趨于凋亡，因此，Bcl-2/Bax值是反映細胞凋亡的敏感指標［12－13］。本研究顯示，經(jīng)鉤藤堿和異鉤藤堿干預后，SHR胸主動脈平滑肌細胞Bax蛋白表達上調(diào)、Bcl-2蛋白表達趨于下調(diào)，從而表明鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿誘導SHR胸主動脈平滑肌細胞凋亡作用與從翻譯水平調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2表達相關(guān)聯(lián)。

正常VSMC處于靜止的非增殖狀態(tài)，主要功能是調(diào)節(jié)血管張力［14］。VSMC增殖是高血壓血管重塑的重要病理變化，是在各種外界剌激的作用下，細胞外信號經(jīng)過細胞內(nèi)信號傳遞系統(tǒng)到達核內(nèi)，誘導一系列與VSMC增殖相關(guān)的基因表達，啟動細胞周期，從而推動VSMC分裂、增殖的結(jié)果［15］。原癌基因的激活及其表達異常是VSMC增殖的內(nèi)在基礎(chǔ)，其中 c-myc 和 c-fos較受關(guān)注［16－17］。c-myc 和 c-fos基因編碼產(chǎn)物c-myc蛋白和c-fos蛋白是細胞核內(nèi)的DNA結(jié)合蛋白，與染色質(zhì)DNA結(jié)合，對促進細胞從G0/G1期進入S期、完成DNA復制和轉(zhuǎn)錄具有關(guān)鍵意義。c-myc和c-fos基因的激活是VSMC增殖的始動因素［18］，其表達增高與VSMC的增殖密切相關(guān)［19］。本實驗發(fā)現(xiàn)，在SHR胸主動脈平滑肌細胞存在c-fos和c-myc蛋白高表達現(xiàn)象，經(jīng)鉤藤堿和異鉤藤堿干預后，SHR胸主動脈平滑肌細胞c-myc和c-fos蛋白表達明顯減弱，表明鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿可通過下調(diào)原癌基因c-myc和c-fos蛋白表達來阻斷SHR胸主動脈VSMC增殖效應。PDGF是VSMC強烈的促絲裂劑和趨化劑，其異常表達是SHR-VSMC生長加速的部分原因之一，與血管增殖病變密切相關(guān)［20－21］。本實驗發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿能抑制SHR胸主動脈PDGF-B mRNA的表達，說明鉤藤提取物可通過該途徑抑制高血壓患者胸主動脈壁平滑肌細胞的增殖。

綜上所述，鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿對SHR胸主動脈VSMC凋亡具有誘導作用，部分機制與下調(diào)Bcl-2蛋白表達、上調(diào)Bax蛋白表達有關(guān);鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿抑制SHR胸主動脈VSMC增殖的作用與下調(diào)c-myc和c-fos蛋白表達以及下調(diào)平滑肌細胞PDGF-B mRNA表達有關(guān)，體現(xiàn)出中藥多途徑、多靶點及整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，從而可以推斷鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿對防治高血壓血管重塑的發(fā)生發(fā)展具有積極意義。

［1］李運倫.鉤藤堿和異鉤藤堿抑制血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞增殖及相關(guān)機制［J］.中國藥理學通報，2008，24(1):53－8.

［1］Li Y L.Effect of rhynchophylline and isorhynchophylline on the proliferation of rat vascular smooth muscle cell induced by angiotensin Ⅱ［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):53 －8.

［2］李運倫.鉤藤堿和異鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ致血管平滑肌細胞凋亡的影響及其機制［J］.中國動脈硬化雜志，2008，16(9):681－4.

［2］Li Y L.Effect and mechanism of rhynchophylline and isorhynchophylline on the apoptosis of rat vascular smooth muscle cell induced by angiotensin Ⅱ［J］.Chin J Arterioscl，2008，16(9):681－4.

［3］孫敬昌，周洪雷，齊冬梅，李運倫.鉤藤提取物對自發(fā)性高血壓大鼠動脈形態(tài)學及血管緊張素Ⅱ的影響［J］.山東中醫(yī)藥大學學報，2011，35(4):351 －3.

［3］Sun J C，Zhou H L，Qi D M，Li Y L.Effect of Gouteng extract on artery morphology and angiotensin Ⅱof SHR［J］.J Shandong Univ TCM，2011，35(4):351 －3

［4］Kockx M M，Knaapen M W.The role of apoptosis in vascular disease［J］.J Pathol，2000，190(3):267 － 80.

［5］Khachigian L M.Catalytic oligonucleotides targeting EGR-1 as potential inhibitors of in-stent restenosis［J］.Ann NY Acad Sci，2001，947:412－5.

［6］張 莉，張長平，李慶平.粉防己堿促進和敏化腎性高血壓大鼠血管平滑肌細胞凋亡［J］.中國臨床藥理學和治療學，2007，12(4):412－6.

［6］Zhang L，Zhang C P，Li Q P.Tetrandrine induces and sensitizes vascular smooth muscle cell apoptosis in renovascular hypertensive rats［J］.Chin J Clin Pharm Ther，2007，12(4):412 －6.

［7］Debbis D，Tea B S，Than V D，Hamet P.Smooth muscle apoptosis during vascular regression in spontaneously hypertensive rats［J］.Hypertension，1997，29:340 －9.

［8］韓雅玲，徐紅梅，鄧 捷，等.E1A激活基因阻遏子過表達抑制體外人血管平滑肌細胞凋亡［J］.生理學報，2006，58(4):324－30.

［8］Han Y L，Xu H M，Deng J，et al.Over-expression of the cellular repressor of E1A-stimulated genes inhibits the apoptosis of human vascular smooth muscle cellsin vitro［J］.Acta Physiol Sin，2006，58(4):324－30.

［9］Cheng G，Shan J，Huang J，et al.Apoptosis induced by simvastatin in rat vascular smooth muscle cell through Ca2+-calpain and caspase-3 pendent pathway［J］.Pharmacol Res，2003，48(6):571－8.

［10］Blanco-Colio L M，Villa A，Ortego M，et al.3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors，atorvastatin and simvastatin，induce apoptosis of vascular smooth muscle cells by downregulation of Bcl-2 expression and Rho A prenylation［J］.Atherosclerosis，2002，161(1):17 －26.

［11］牛英才，潘 志，李曉明，等.葛根異黃酮對 MPP+誘導的PC12細胞凋亡的保護作用［J］.中國藥理學通報，2009，25(1):112－5.

［11］Niu Y C，Pan Z，Li X M，et al.The protection action of total isoflavones from pueraria lobata against MPP+induced PC12 cellular apoptosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):112 － 5.

［12］萬新紅，鄧利芝，陳朝霞，等.血管平滑肌細胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達在自發(fā)性高血壓大鼠頸動脈血管間質(zhì)膠原重構(gòu)及逆轉(zhuǎn)中的意義［J］.介入放射學雜志，2004，12(suppl 2):197－200.

［12］Wan X H，Deng L Z，Chen Z X，et al.Vascular collagen remodeling，apoptosis and bcl-2/bax of vascular smooth muscle cells in carotid artery on SHR［J］.J Intervent Radiol，2004，12(suppl 2):197－200.

［13］余良主，化長林，黃碧蘭，朱曉琴.L-精氨酸對高血壓大鼠主動脈平滑肌細胞凋亡的影響［J］.咸寧學院學報(醫(yī)學版)，2006，20(5):396 －9.

［13］Yu L Z，Hua C L，Hang B L，Zhu X Q.Effect ofL-argine on the apoptosis of EH rat aorta vascular smooth muscle cell［J］.J Xianning Coll(Med Sci)，2006，20(5):396 －9.

［14］李 磊，戴 敏.動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮分泌功能失調(diào)與平滑肌細胞增殖［J］.中國藥理學通報，2010，26(2):155 －8.

［14］Li L，Dai M.Research progress in osteopontin and pulmonary fibrosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(2):155 －8.

［15］許曉樂，張 偉，黃燕娟，王玉琴.二苯乙烯苷對平滑肌細胞增殖及其抗氧化作用的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(7):934－9.

［15］Xu X L，Zhang W，Huang Y J，Wang Y Q.Effect of 2，3，4，5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-Dglucoside on proliferation and antioxidation of vascular smooth muscle cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(7):934 －9.

［16］劉艷春，劉 波，張 炎，姜宗來.低切應力對體外培養(yǎng)血管中膜平滑肌細胞原癌基因c-fos和c-myc表達的影響［J］.生物物理學報，2004，20(6):434 －7.

［16］Liu Y C，Liu B，Zhang Y，Jiang Z L.Effect of low shear Stress on expression of c-fos and c-myc protein cultured arteryin vitro［J］.Acta Biophys Sin，2004，20(6):434 －7.

［17］吳錦暉，章茂順，王家良，符宗胤.醋柳黃酮及其單體對培養(yǎng)自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞c-myc表達的影響［J］.華西藥學雜志，2001，16(1):72 －3.

［17］Wu J H，Zhang M S，Wang J L，F(xiàn)u Z Y.The effect of TFH and its monomer on the c-myc expression in the vascular smooth muscle cells of SHR［J］.West China J Pharm Sci，2001，16(1):72 －3.

［18］Braun Dullaeus R C，Mann M J，Sedding D G，et al.Cell cycle dependent regulation of smooth muscle cell activation［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(5):845 －50.

［19］Hilker M，Tell nann G，Buerke M，et al.Expression of the proto oncogene c-myc in human stenotic aortocoronary by passgrafts［J］.Patho Res Pract，2001，197(12):811 －6.

［20］李慧麗，黃定九.胰島素對高血壓大鼠血管平滑肌細胞血小板源生長因子A鏈和轉(zhuǎn)化生長因子β1表達的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床，2001，21(1):28 －31.

［20］Li H L，Huang D J.The effect of insulin on PDGF chain A and expression of TGF β1［J］.Basic Med Sci Clin，2001，21(1):28 －31.

［21］黃 警，黃燮南，張 紓，等.人參總皂苷對PDGF-BB所致血管平滑肌細胞增殖周期的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(6):787－91.

［21］Huang J，Huang X N，Zhang S，et al.Effect of total ginsenosides on the cell cycle of rat smooth muscule cell proferration induced by PDGF-BB［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(6):787 －91.