新型芳烷酮哌嗪類衍生物YX0611-1對坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷大鼠的鎮(zhèn)痛作用

王玉梅，謝 煒，徐祥清，劉世成，盛雨辰

(1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海200040，2.江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，江蘇 徐州 221007)

神經(jīng)病理性疼痛是指由中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的疼痛綜合征。其疼痛機(jī)制極其復(fù)雜，治療困難，常規(guī)鎮(zhèn)痛藥物治療無明顯療效。已有研究表明，脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體在病理性疼痛的形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［1］，特別是NMDA受體的2B亞基(NR2B)在疼痛的產(chǎn)生及中樞性痛覺敏化形成中起到重要作用［2］。

因此，針對NMDA受體多胺位點設(shè)計合成了芳烷酮哌嗪類衍生物新結(jié)構(gòu)化合物，以期尋找新型非阿片類鎮(zhèn)痛藥物。前期研究表明［3～5］，芳烷酮哌嗪類衍生物具有明顯鎮(zhèn)痛活性，其中優(yōu)選活性化合物YX0611-1實驗結(jié)果顯示對小鼠醋酸扭體實驗?zāi)Ｐ?、小鼠熱板實驗?zāi)Ｐ?、大鼠蜂毒致痛實驗?zāi)Ｐ图按笫笞巧窠?jīng)分支選擇損傷模型(SNI)4種疼痛模型均有效，表現(xiàn)出了良好的抗急性痛和抗神經(jīng)病理性疼痛的效能。為進(jìn)一步考查YX0611-1對神經(jīng)病理性疼痛的效果，我們擬構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎(chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI)模型，進(jìn)一步驗證YX0611-1對大鼠神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，為該化合物的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)和決策參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物、儀器、試劑成年SD大鼠，♂，體質(zhì)量140～180 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，飼養(yǎng)于正壓凈化通風(fēng)動物房內(nèi)，室溫(24±1)℃，濕度40% ～70%，人工照明模擬晝夜變化，自由進(jìn)食與飲水。

Electronic von Frey纖毛儀，美國IITC Life Science Inc公司產(chǎn)品。熱痛刺激儀BME-410A，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所。

加巴噴丁(gabapentin)原料藥，批號:20100301，普瑞巴林(pregabalin)原料藥，批號:20100301，由江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司提供，臨用時用生理鹽水配成相應(yīng)濃度。YX0611-1，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院化學(xué)制藥部提供，批號:20100801，臨用時用生理鹽水配成相應(yīng)濃度。鹽酸嗎啡(morphine)注射液，東北制藥集團(tuán)公司沈陽第一制藥廠生產(chǎn)，批號:20100510，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H21022436。水合氯醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號:T20100322。

1.2實驗動物分組及給藥大鼠隨機(jī)分為7組，分別為假手術(shù)組、模型組、加巴噴丁(100 mg·kg－1)組、鹽酸嗎啡(10 mg·kg－1)組、普瑞巴林(40 mg·kg－1)組以及 YX0611-1 高劑量(160 mg·kg－1)組、中劑量(80 mg·kg－1)組，每組10只。假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)而不進(jìn)行結(jié)扎，其他制備坐骨神經(jīng)結(jié)扎(CCI)模型，各組大鼠手術(shù)前1 d測定機(jī)械刺激閾值和熱刺激潛伏期，術(shù)后d 7測定機(jī)械刺激閾值和熱刺激潛伏期以確定是否造模成功。造模成功的大鼠于手術(shù)后d 8灌胃給藥(鹽酸嗎啡組腹腔注射)，假手術(shù)組和模型組給予等體積的溶劑(生理鹽水)，連續(xù)給藥6 d，每天1次。各組給藥d 1和最后1 d進(jìn)行測定機(jī)械刺激閾值和熱刺激潛伏期測定，假手術(shù)組、模型組、普瑞巴林組、YX0611-1高、中劑量組給藥后60 min測定，加巴噴丁組給藥后120 min測定，鹽酸嗎啡組給藥后30 min測定。

1.3坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型(CCI)的制備按照Benett等［6］的方法制備CCI模型，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg·kg－1)，麻醉后右下肢剪毛、常規(guī)消毒，在股骨外側(cè)切開長約2 cm的縱行切口，切開皮膚及皮下組織，順肌紋鈍性分離肌肉，于股骨后找到坐骨神經(jīng)主干，暴露坐骨神經(jīng)，游離周圍組織，在接近其分叉之前游離出約7 mm的神經(jīng)，用4根4-0的手術(shù)線間隔1mm進(jìn)行松結(jié)扎，結(jié)扎線以引起大鼠腿部輕微抽搐、收縮或蹬腿而不影響神經(jīng)外膜的血運，使神經(jīng)外膜輕度凹陷為度，然后逐層縫合。手術(shù)時間8～12 min，術(shù)后每只肌注青霉素2次，每次8萬單位。

1.4機(jī)械刺激閾值測量將大鼠置于透明的有機(jī)玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)中，底為0.5 cm×0.5 cm孔徑的鐵絲網(wǎng)。實驗前使之適應(yīng)30 min。用Electronic von Frey垂直刺激術(shù)側(cè)后肢足底中部，緩慢施加力度，直到大鼠抬足或舔足，此力度為機(jī)械刺激閾值，測定4次，為避免或減少前一次刺激對隨后刺激效應(yīng)造成的影響，同一部位刺激的間隔時間為3 min，取其平均值。

1.5熱刺激潛伏期測量將大鼠置于底為3 mm厚玻璃板的有機(jī)玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)中，使其適應(yīng)30 min后用BME-410A型熱輻射刺激儀照射大鼠足底。照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時間為熱刺激潛伏期。切斷時間為60 s，以防止組織損傷;測定4次，為避免或減少前一次刺激對隨后刺激效應(yīng)造成的影響，同一部位刺激的間隔時間為3 min，取其平均值。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1大鼠機(jī)械刺激閾值和熱刺激潛伏期基礎(chǔ)值及d 7測定值結(jié)果表明，與基礎(chǔ)值相比，假手術(shù)組d 7時機(jī)械閾值和熱刺激潛伏期都沒有明顯變化;各組造模大鼠d 7時機(jī)械刺激閾值和熱刺激潛伏期明顯降低(P＜0.05)。結(jié)果見Tab 1、2。

2.2YX0611-1對CCI模型大鼠機(jī)械刺激閾值和熱刺激潛伏期的影響在實驗的d 8和d 13的上午給藥后分別測定各組大鼠的機(jī)械刺激閾值和熱刺激潛伏期，與模型組相比，YX0611-1單次給藥160和80 mg·kg－1均能明顯提高大鼠的機(jī)械刺激閾值和熱刺激潛伏期(P＜0.05)，化合物YX0611-1的160 mg·kg－1組多次給藥能明顯提高大鼠的機(jī)械刺激閾值和熱刺激潛伏期(P＜0.05)，化合物YX0611-1的80 mg·kg－1組多次給藥均能明顯提高大鼠的熱刺激潛伏期(P＜0.05)，說明該化合物在該劑量下具有較好的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果見Tab 3，4。

Tab 1 The paw withdrawal mechanical threshold of the baseline and measured value of the seventh day(±s)

Tab 1 The paw withdrawal mechanical threshold of the baseline and measured value of the seventh day(±s)

＊＊P＜0.01 vs baseline value;##P＜0.01 vs sham

Group Dose/mg·kg－1 Withdrawal mechanical threshold/g Baseline value d 7 value Sham － 59.8 ±6.9 57.6 ±10.0 Model － 60.1 ±8.9 42.7 ±6.6＊＊##YX0611-1 160 60.2 ±8.5 41.9 ±9.3＊＊##80 56.5 ±8.9 35.7 ±4.4＊＊##Morphine 10 63.8 ±6.8 37.8 ±6.9＊＊##Gabapentin 100 65.2 ±9.6 35.5 ±5.1＊＊##Pregabalin 40 63.4 ±7.3 35.3 ±5.6＊＊##

Tab 2 The Paw withdrawal thermal latency of the baseline and measured value of the seventh day(±s)

Tab 2 The Paw withdrawal thermal latency of the baseline and measured value of the seventh day(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs baseline value;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs sham

Group Dose/mg·kg－1 withdrawal thermal latency/s Baseline value d 7 value Sham － 12.8 ±5.5 13.2 ±6.5 Model － 11.2 ±3.6 7.2 ±2.8*#YX0611-1 160 10.4 ±3.6 5.7 ±2.3＊＊##80 13.3 ±5.7 5.7 ±1.9＊＊##Morphine 10 10.0 ±3.7 6.0 ±2.4*##Gabapentin 100 9.9 ±4.7 7.2 ±3.5*#Pregabalin 40 13.5 ±6.3 5.2 ±1.4＊＊##

3 討論

Tab 3 Effect of of YX0611-1 on the paw withdrawal mechanical threshold of CCI rats(±s)

Tab 3 Effect of of YX0611-1 on the paw withdrawal mechanical threshold of CCI rats(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1 Withdrawal mechanical threshold/g d 8 d 13 Sham － 58.9 ±12.2 63.9 ±8.8 Model － 36.4 ±6.1 37.9 ±5.0 YX0611-1 160 48.5 ±12.3* 48.5 ±11.7＊＊80 42.8 ±3.0＊＊ 38.4 ±6.2 Morphine 10 50.4 ±8.0＊＊ 49.4 ±8.9＊＊Gabapentin 100 44.6 ±4.1＊＊ 43.7 ±6.2*Pregabalin 40 45.1 ±7.1＊＊ 47.5 ±8.2*

中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(excite mental amino acid，EAAs)是谷氨酸，谷氨酸及其受體參與脊髓水平傷害性信息的傳遞和整合。N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR，NR)是谷氨酸受體的一種類型，屬于離子型受體。該受體由NR1、NR2AD及NR3A-B 7種亞單位組成［7］，谷氨酸的結(jié)合位點由NR2B組成［8］，脊髓背角神經(jīng)元NR的激活在疼痛的中樞致敏過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］，NMDA受體在痛敏中激活的信號傳導(dǎo)通路包括對蛋白激酶C(PKC)的激活，對NO-cGMP通路的激活以及脊髓錳過氧化物歧化酶的硝化失活［10］等。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)NR2B是NR參與疼痛產(chǎn)生的調(diào)節(jié)亞基［11］，NR2B受體與疼痛的傳導(dǎo)密切相關(guān)［12］。NR2B在疼痛的產(chǎn)生及中樞性痛覺敏化形成中起到重要作用［13］，NR2B高表達(dá)提示疼痛程度加強(qiáng)。腦室內(nèi)注射NR2B拮抗劑明顯減輕福爾馬林引起的大鼠疼痛［14］。

Tab 4 Effect of of YX0611-1 on the paw withdrawal thermal latency of CCI rats(±s)

Tab 4 Effect of of YX0611-1 on the paw withdrawal thermal latency of CCI rats(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1 Withdrawal thermal latency/s d 8 d 13 Sham － 11.7 ±4.3 12.2 ±5.44 Model － 7.3 ±3.0 6.1 ±2.0 YX0611-1 160 10.4 ±2.7* 9.3 ±3.7*80 12.5 ±6.5* 9.4 ±3.5*Morphine 10 15.7 ±7.0＊＊ 17.1 ±6.9＊＊Gabapentin 100 10.9 ±3.0* 11.2 ±6.7*Pregabalin 40 12.2 ±4.7* 10.8 ±5.9*

CCI模型是研究神經(jīng)病理性疼痛的經(jīng)典模型，其疼痛特征和臨床上神經(jīng)病理性疼痛頗為相似，常用來研究神經(jīng)病理性疼痛［15］。本實驗采用CCI模型，結(jié)果顯示，陽性藥物對照組(嗎啡組、加巴噴丁組、普瑞巴林組)單次和多次給藥能明顯提高大鼠機(jī)械刺激閾值，延長大鼠熱刺激潛伏期(P＜0.05)，表明陽性藥物嗎啡、加巴噴丁、普瑞巴林對CCI模型有鎮(zhèn)痛作用，也表明 CCI模型是成功建立的;YX0611-1 160 mg·kg－1組和 80 mg·kg－1組單次給藥均能明顯提高大鼠的機(jī)械刺激閾值，延長大鼠熱刺激潛伏期(P＜0.05);YX0611-1 160 mg·kg－1組多次給藥能明顯提高大鼠機(jī)械刺激閾值，延長大鼠熱刺激潛伏期(P＜0.05);YX0611-1 80 mg·kg－1組多次給藥能明顯提高大鼠的熱刺激潛伏期(P＜0.05)，以上結(jié)果進(jìn)一步證明了YX0611-1對神經(jīng)病理性疼痛有較好的鎮(zhèn)痛作用，與藥物嗎啡、加巴噴丁、普瑞巴林鎮(zhèn)痛效果相當(dāng)。80 mg·kg－1組多次給藥提高大鼠的機(jī)械刺激閾值，但差別無統(tǒng)計學(xué)意義，其原因不清楚，可能有藥物耐受性，需要在以后實驗中進(jìn)一步研究，同時可加設(shè)40 mg·kg－1劑量組。

化合物YX0611-1對神經(jīng)病理性疼痛有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，其作用機(jī)制可能是通過以下途徑抑制NR2B的表達(dá):①抑制NMDA受體的激活;② 特異性地阻斷NR2B受體;③抑制蛋白激酶 C的激活;④抑制NO-cGMP通路的激活;⑤ 抑制蛋白酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶的激活等等，其具體鎮(zhèn)痛機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

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