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    萬古霉素單用及聯(lián)合利福平或磷霉素對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌防耐藥突變濃度的研究

    2011-06-09 02:11:12朱玉林李家斌
    關(guān)鍵詞:磷霉素利福平萬古霉素

    梅 清,喻 婷,朱玉林,程 君,2,3,葉 英,2,3,李家斌,2,3

    (1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科,2安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心,3安徽醫(yī)科大學(xué)細(xì)菌耐藥研究所,安徽合肥 230022)

    萬古霉素是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)感染的首選藥物,但隨著萬古霉素的廣泛應(yīng)用,其最小抑菌濃度(MIC)逐年上升,形成“MIC漂移”現(xiàn)象[1]。萬古霉素中介(VISA)、異質(zhì)性萬古霉素中介(hVISA)以及萬古霉素耐藥(VRSA)的金黃色葡萄球菌也在美國(guó)、日本等多個(gè)國(guó)家被陸續(xù)報(bào)道[2]。目前預(yù)防MRSA菌株進(jìn)一步突變,保護(hù)萬古霉素抗感染活性已成為臨床醫(yī)務(wù)工作者的當(dāng)務(wù)之急。

    耐藥突變選擇窗(mutant selection window,MSW)理論是近年來提出的一個(gè)遏制抗菌藥物耐藥的新策略[3]??咕幬餄舛任挥谝吧舾兄闙IC和防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration,MPC)之間時(shí),耐藥突變體就會(huì)被選擇性富集擴(kuò)增。當(dāng)藥物濃度高于MPC時(shí),這種富集則被抑制。但是由于藥物安全性問題,臨床上單獨(dú)應(yīng)用一種抗菌藥物,要獲得血漿或組織中藥物濃度長(zhǎng)時(shí)間位于MPC以上是很困難的。本研究通過測(cè)定萬古霉素單用及分別與利福平、磷霉素聯(lián)合使用對(duì)10株MRSA臨床分離株的防耐藥突變濃度的變化,在體外初步探討兩種不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用防止耐藥突變體的產(chǎn)生的影響,以指導(dǎo)臨床合理用藥。

    1 材料與方法

    1.1菌株來源與鑒定安徽省細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)中心2009~2010年收集的臨床標(biāo)本。從中選取10株對(duì)萬古霉素、利福平敏感,同時(shí)對(duì)磷霉素的MIC≤16.0 mg·L-1的MRSA臨床分離株。MRSA的鑒定參照文獻(xiàn)[4]的方法,所有菌株均擴(kuò)增出甲氧西林耐藥基因(mecA)和具有金黃色葡萄球菌種特異性的耐熱核酸酶基因(nuc)。

    1.2培養(yǎng)基與儀器M-H培養(yǎng)基購自英國(guó)Oxiod公司。恒溫振蕩培養(yǎng)箱(國(guó)勝儀器廠,江蘇);細(xì)菌比濁儀(Oxiod,英國(guó));32R低溫離心機(jī)(Hettich,德國(guó));多點(diǎn)接種儀(AQS Manufacturing公司,英國(guó))。

    1.3抗菌藥物及試劑萬古霉素 (VAN,批號(hào):130360-200301純度:100%)和磷霉素 (FOS,批號(hào):130350-200001純度:99%)均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。利福平(RFP,批號(hào):13292-46-1,250 mg/瓶,純度:97%)和6-磷酸葡萄糖(500 mg/瓶,純度:98% ~100%)均購自Sigma公司 。

    1.4最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定采用瓊脂平板倍比稀釋法,結(jié)果按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)CLSI2010年標(biāo)準(zhǔn)[5]判讀。磷霉素采用瓊脂稀釋法進(jìn)行MIC,測(cè)定時(shí)按照CLSI要求每個(gè)瓊脂平板加入終濃度為25 mg·L-1的6-磷酸葡萄糖。

    1.5防耐藥突變濃度(MPC)的測(cè)定[6]

    1.5.1含單藥瓊脂平板的配制采用瓊脂平板倍比稀釋法測(cè)定抗菌藥物對(duì)10株MRSA分離株的MPC。以各單藥MIC為基準(zhǔn),倍比稀釋7個(gè)濃度配置瓊脂平板。藥物終濃度分別為各菌株的1×MIC、2×MIC……64×MIC。每個(gè)濃度配制4個(gè)平板。在測(cè)定磷霉素的MPC時(shí),每個(gè)瓊脂平板均加入終濃度為25 mg·L-1的6-磷酸葡萄糖。

    Tab 1 MICs of 3 antimicrobial agents against 10 strains of MRSA(mg·L-1)

    1.5.2含兩藥瓊脂平板的配制以VAN的MIC、MPC為基準(zhǔn),采用倍比稀釋法配制含兩藥的瓊脂平板,具體方法:分別精密量取1 ml不同MIC倍數(shù)濃度的VAN+1 ml濃度為4.0 mg·L-1的RFP 或1 ml濃度為48.0 mg·L-1的FOS(均為常規(guī)用藥后平均血漿藥物濃度[7])+18 ml M-H瓊脂,在90 mm平皿中混勻,配制成一系列不同濃度的含兩藥瓊脂平板,每個(gè)濃度配制4個(gè)平板。

    1.5.3MPC以及耐藥頻率的測(cè)定從新鮮過夜培養(yǎng)的細(xì)菌平板上挑取單個(gè)菌落接種于20 ml MH肉湯中37℃震蕩過夜培養(yǎng),3 000 r·min-1離心后棄上清液,細(xì)菌再懸浮于200 ml的新鮮MH肉湯中,震蕩培養(yǎng)6 h,離心后將菌液濃度調(diào)整為3×1010CFU·ml-1。取 100 μl菌液放在 90 mm 直徑含不同濃度藥物的MH瓊脂平板上,用L形棒涂布均勻,每個(gè)濃度4個(gè)平板,使每個(gè)藥物濃度的細(xì)菌總接種量為1.2×1010CFU。35℃培養(yǎng)72 h,以無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MPC。每次試驗(yàn)均對(duì)接種菌液稀釋后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),以確定接種細(xì)菌量在1010以上。對(duì)接近MPC藥物濃度篩選出來菌株接種于不含藥物的瓊脂平板上,傳代2次后再接種于原篩選藥物濃度的平板上,以確定其為耐藥突變體。耐藥頻率的計(jì)算按照文獻(xiàn)[8]:將不同藥物濃度平板上的菌落數(shù)除以接種的菌落數(shù)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取其平均值。

    1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1抗菌藥物對(duì)MRSA的MIC值VAN、RFP和FOS對(duì)10株MRSA的MIC值見Tab 1。

    2.2抗菌藥物單用及聯(lián)合使用對(duì)MRSA的MPC和SI值VAN單用及分別與RFP和FOS聯(lián)合使用,對(duì)10株MRSA的MPC和選擇指數(shù)(SI=MPC/MIC)見Tab 2。RFP和FOS單用對(duì)10株MRSA的MPC分別為 >1 024 mg·L-1和128 ~1 024 mg·L-1。

    Tab 2 MPC(mg·L-1)and SI for vancomycin alone and in combination with rifampicin and fosfomycin respectively against 10 strains of MRSA

    2.3耐藥頻率VAN單用以及分別RFP及FOS聯(lián)合使用對(duì)10株MRSA的耐藥頻率見Tab 3。

    Tab 3 Drug-resistant frequencies of vancomycin alone and in combination with rifampicin and fosfomycin respectively against 10 strains of MRSA

    3 討論

    MRSA是引起醫(yī)院感染的重要致病菌,具有多重耐藥性,治療困難,病死率高,是目前臨床治療的難題[9]。萬古霉素一直被認(rèn)為是MRSA感染的標(biāo)準(zhǔn)治療,但有報(bào)道稱其對(duì)MRSA引起的下呼吸道院內(nèi)感染治療失敗率高達(dá)40%以上[10]。MSW理論[3]認(rèn)為:抗菌藥物治療失敗和耐藥菌株的產(chǎn)生可能與臨床藥物劑量落在耐藥突變選擇窗內(nèi)有關(guān),即只殺滅敏感細(xì)菌,而菌群中少數(shù)自發(fā)耐藥突變體則被選擇性富集。當(dāng)藥物濃度高于MPC時(shí),病原菌必須同時(shí)發(fā)生兩次或更多次耐藥突變才能生長(zhǎng),這樣耐藥突變體出現(xiàn)的可能性將極小。因此MPC可作為一項(xiàng)指標(biāo)來評(píng)價(jià)抗菌藥物的抗菌活性、反映藥物抑制耐藥突變選擇的能力。胡暉等[11]測(cè)定了122株MRSA臨床分離株對(duì)萬古霉素的MPC,結(jié)果顯示其MPC90值為22.4 mg·L-1。這與本研究中10株MRSA對(duì)萬古霉素的MPC為16~64 mg·L-1的結(jié)果接近。結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)看,萬古霉素常規(guī)劑量使用后血漿峰濃度Cmax為 25~40 mg·L-1,略高于MPC值,但是由于萬古霉素組織穿透性弱,在肺、骨等組織中分布的藥物濃度遠(yuǎn)低于血漿濃度[12],往往使感染部位的藥物濃度恰好落在MSW之內(nèi),若要增大給藥劑量,卻可能產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用,所以在這種情況下萬古霉素單獨(dú)使用限制耐藥突變體富集的能力并不理想。

    MSW理論提供了一種限制耐藥突變體產(chǎn)生的方法[3]:選擇不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用從而關(guān)閉或縮小MSW,達(dá)到防止細(xì)菌耐藥產(chǎn)生同時(shí)不增加不良反應(yīng)的目的。李朝霞等[6]報(bào)道在瓊脂平板實(shí)驗(yàn)中,萬古霉素與左氧氟沙星聯(lián)合使用可以使左氧氟沙星單藥對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213的MSW縮小2~4倍,使萬古霉素單藥對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213的MSW縮小4~8倍。Firso等[13]運(yùn)用體外藥效學(xué)模型,成功地證明了莫西沙星+多西環(huán)素在防止金黃色葡萄球菌發(fā)生耐藥方面具有協(xié)同作用。近幾年耐甲氧西林葡萄球菌的耐藥性監(jiān)測(cè)顯示萬古霉素、利福平以及磷霉素對(duì)MRSA仍保持較高的敏感率[14]。本研究將萬古霉素與利福平、磷霉素聯(lián)合使用,SI較其單用分別下降2~16倍和4~32倍,再次證實(shí)了不同作用機(jī)制的抗菌藥物聯(lián)合使用可以降低MPC,縮小MSW,減少耐藥菌的生成。這是因?yàn)榧?xì)菌通過單步變異產(chǎn)生耐藥菌的概率為10-7,如果聯(lián)合用藥,細(xì)菌必須通過一步變異同時(shí)獲得對(duì)兩種藥物的耐藥,理論上其發(fā)生率僅為10-14,而人體感染部位的細(xì)菌數(shù)量可達(dá)到1010CFU卻遠(yuǎn)低于1014CFU,因此很難發(fā)生自發(fā)耐藥變異。

    本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)萬古霉素與磷霉素聯(lián)合縮小MRSA耐藥突變窗的能力強(qiáng)于萬古霉素與利福平的聯(lián)合方案(P<0.01)。這可能與磷霉素和利福平各自限制耐藥突變體富集的能力有關(guān)。雖然利福平對(duì)10株MRSA的 MIC≤0.016 mg·L-1,MPC 卻高到無法測(cè)出(>1 024 mg·L-1),而磷霉素的MPC則為128~1 024 mg·L-1,其MSW較利福平窄的多。因此,各單藥的MSW越窄,聯(lián)合使用后MPC降低的幅度越大。這一特征與聶大平等[15]對(duì)銅綠假單胞菌防耐藥突變濃度的研究得出的結(jié)論一致。

    從耐藥頻率看,萬古霉素分別與利福平、磷霉素聯(lián)用,較單用時(shí)耐藥頻率均有明顯下降(P<0.01)。也就是說,雖然聯(lián)合用藥時(shí)低濃度萬古霉素(如1×MIC、2×MIC)瓊脂平板上仍然有耐藥突變體的產(chǎn)生,但其數(shù)量大幅降低,這從另一角度也反映出聯(lián)合用藥較單獨(dú)用藥更能防止耐藥突變體的富集。

    萬古霉素分別與其他抗菌藥物聯(lián)合治療MRSA感染的方案早有報(bào)道,但以往的研究大部分基于傳統(tǒng)的MIC治療策略[16]。本研究依據(jù)遏制抗菌藥物耐藥的新理論,對(duì)萬古霉素分別聯(lián)合利福平和磷霉素在防耐藥突變濃度方面進(jìn)行了初步的探討,結(jié)果表明這兩種聯(lián)合方案能夠有效的防止耐藥突變體的富集,為臨床合理利用現(xiàn)有抗菌藥物治療MRSA感染,防止耐藥菌的產(chǎn)生提供了理論依據(jù)。由于體內(nèi)藥物濃度處于動(dòng)態(tài)變化中,受到的影響因素也較多,因此聯(lián)合用藥時(shí)藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)參數(shù)與耐藥突變體富集的關(guān)系還需要在體內(nèi)試驗(yàn)中得到進(jìn)一步的研究。

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