結(jié)直腸癌ZIC1和KLOTHO基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的臨床價(jià)值初探

甘麗虹，潘 潔，陳淑潔，鐘 菁，王良靜

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院消化科，浙江 杭州 310009;2.浙江大學(xué)邵逸夫臨床醫(yī)學(xué)研究所消化研究室，浙江 杭州 310016)

結(jié)直腸癌是目前世界上發(fā)病率排名第三的惡性腫瘤［1］。結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多基因遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變的累積過(guò)程，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活［2］。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)改變的一種主要形式，在抑癌基因的失活機(jī)制中扮演著重要角色［3］。研究表明，DNA異常甲基化在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，多種基因DNA甲基化有可能成為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后判斷的重要標(biāo)志物［4-5］。

我們?cè)ㄟ^(guò)cDNA微陣列分析(cDNA microarray)進(jìn)行基因組掃描和甲基化研究，發(fā)現(xiàn)ZIC1和KLOTHO基因的表達(dá)可能受到DNA甲基化的調(diào)控［6］。但有關(guān)ZIC1和KLOTHO在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

ZIC是1994年Aruga在成年鼠小腦中發(fā)現(xiàn)的一類編碼鋅指結(jié)構(gòu)蛋白的基因，包括ZIC 1～5共5個(gè)成員，其中ZIC1位于3q24，含3個(gè)外顯子，編碼一種C2H2型鋅指蛋白［7］。多個(gè)研究報(bào)道，ZIC1在神經(jīng)腦發(fā)育中發(fā)揮重要作用［8-9］;而且，其與多種腫瘤如髓母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、間質(zhì)腫瘤和胃癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［6，10-12］。KLOTHO 是 1997 年 Kuro 等人首先從衰老表現(xiàn)的小鼠模型中克隆成功［13-14］;研究發(fā)現(xiàn)，KLOTHO基因功能缺陷是導(dǎo)致衰老的重要原因，但KLOTHO可能還具有抑癌基因的功能［15］。本研究主要探討ZIC1和KLOTHO基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)結(jié)直腸癌臨床診斷的潛在價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料 25對(duì)結(jié)直腸癌組織及癌旁組織均取自浙江大學(xué)邵逸夫醫(yī)院外科手術(shù)標(biāo)本。Trizol購(gòu)自 Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)和TaqGold DNA聚合酶購(gòu)自Applied Biosystems公司，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒(SYBR PremixEx Taq PCR)購(gòu)自Takara公司，EZ DNA Methylation-Gold Kit購(gòu)自Zymo Research公司。

1.2 方法

1.2.1 病例 入選結(jié)直腸癌患者25例，其中男性16人，平均年齡64歲;女性9人，平均年齡61.33歲。術(shù)中取癌和癌旁相對(duì)正常的兩處組織標(biāo)本，手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)有豐富經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師明確診斷。其中，高分化腺癌17例，中分化腺癌7例，低分化腺癌1例。癌旁組織經(jīng)病理證實(shí)為無(wú)癌細(xì)胞的相對(duì)正常組織。TNM分期，Ⅰ期5例，Ⅱ期(ⅡA、ⅡB)10例，Ⅲ(ⅢA、ⅢB、ⅢC)9例，Ⅳ期1例。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照試劑說(shuō)明書(shū)用Trizol試劑提取結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織 RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，按照 SYBR PremixEx Taq PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作PCR，并以GAPDH作為內(nèi)參照。反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件:95℃變性2 min，然后變性95℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min，并進(jìn)行溶解曲線分析及1.5%瓊脂糖凝聚電泳驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性。每個(gè)樣本均檢測(cè)3次，取其平均值計(jì)算 ZIC1、KLOTHO mRNA的表達(dá)水平。用-△△CT法計(jì)算ZIC1和KLOTHO mRNA在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)變化。PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì):ZIC1正義:5'-AAACTGGTTAACCACATC CGC，反 義:5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG;KLOTHO正義:5'-ACCTGGTGGCGCACAACC，反義:5'-TTGGCAAACCAACCTAGTACA;GAPDH正義:5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT，反義:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC。

1.2.3 DNA的亞硫酸鹽處理及甲基化特異性PCR 提取結(jié)直腸癌組織及癌旁組織的DNA，取500 ng DNA進(jìn)行亞硫酸鹽處理，按照EZ DNA Methylation-Gold Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，取處理后的 DNA 1 μl作為模板使用 TaqGold DNA聚合酶進(jìn)行甲基化特異性PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系 12.5 μl，反應(yīng)條件:95℃變性 10 min，然后變性95℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，在紫外檢測(cè)儀上觀察產(chǎn)物條帶。相關(guān)引物:ZIC1(M)正義:5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC，反義:5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG;ZIC1(U)正義:5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT，反義:5'-CCCATTAACCACATTAAACA;KLOTHO(M)正義:5'-GTCGTCGTTGTAGTTCGTTATC，反 義: 5'-CAACAAACGCCGATAATAACG;KLOTHO(U)正義:5'-TTGTTGTTGTTGTAG TTTGTTATT，反義:5'-CCAACAAACACCAATA ATAAC。(M):甲基化引物;(U):非甲基化引物。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 使用 GraphPad Prism 5.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌和癌旁組織ZIC1和KLOTHO mRNA相對(duì)表達(dá)情況用-△△CT值的中位數(shù)(25% ～75%四分位間距)描述，采用配對(duì)Wilcoxon等級(jí)秩和檢驗(yàn)分析;ZIC1和KLOTHO mRNA表達(dá)與臨床病理資料關(guān)系采用非參數(shù)Mann Whitney和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Dunn's多重檢驗(yàn);ZIC1和KLOTHO啟動(dòng)子甲基化與臨床病例資料相關(guān)性采用Fisher精確檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZIC1和KLOTHO mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào) 以GAPDH作為內(nèi)參照，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示:與癌旁正常組織相比，ZIC1和KLOTHO mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)均明顯下調(diào)(P均＜0.0001)，見(jiàn)表1。進(jìn)一步分析ZIC1和KLOTHO mRNA表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織ZIC1 mRNA相對(duì)定量表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及腫瘤TNM分期無(wú)明顯相關(guān)(P＞0.05);KLOTHO mRNA表達(dá)與患者年齡分布有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，而與患者性別、腫瘤分化程度及腫瘤TNM分期無(wú)明顯相關(guān)(P＞0.05)，見(jiàn)表 2、表 3。

2.2 結(jié)直腸癌組織中ZIC1和KLOTHO基因啟動(dòng)子高甲基化 甲基化特異性PCR(MSP)結(jié)果顯示，在25例結(jié)直腸癌組織中ZIC1甲基化陽(yáng)性率為80%(20/25)，KLOTHO甲基化陽(yáng)性率為76%(19/25)，ZIC1和KLOTHO聯(lián)合甲基化的陽(yáng)性率為64%(16/25)。在檢測(cè)標(biāo)本中，部分癌旁正常組織出現(xiàn)較癌組織弱的甲基化(M)表達(dá)條帶，說(shuō)明組織學(xué)上相對(duì)正常的結(jié)腸癌旁組織可以發(fā)生部分甲基化(圖1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌和癌旁組織中ZIC1和KLOTHO mRNA表達(dá)Table 1 The result of real-time quantitative RT-PCR analysis of ZIC1 and KLOTHO mRNA expression in colorectal cancer and adjacent non-tumor tissues (n=25，中位數(shù)，25% ～75%)

表2 結(jié)直腸癌ZIC1 mRNA表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系Table 2 The relationship between the expression of ZIC1 mRNA and clinicopathological features in colorectal cancers(n=25，中位數(shù)，25% ～75%)

圖1 MSP檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中ZIC1和KLOTHO基因啟動(dòng)子甲基化表達(dá)Fig.1 The promoter methylation status of ZIC1 and KLOTHO were detected by methylation specific PCR(MSP)in colorectal cancer and adjacent nontumor tissues

表3 結(jié)直腸癌KLOHTO mRNA表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系Table 3 The relationship between the expression of KLOTHO mRNA and clinicopathological features in colorectal cancers(n=25，中位數(shù)，25% ～75%)

進(jìn)一步對(duì)ZIC1和KLOTHO甲基化狀態(tài)和臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)ZIC1和KLOTHO同時(shí)甲基化與年齡分布相關(guān)(P＜0.05)，但與患者性別、腫瘤分化程度、腫瘤TNM分期無(wú)明顯相關(guān)性(P ＞0.05)，見(jiàn)表4。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生是遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變共同作用的結(jié)果［16］。表觀遺傳學(xué)改變主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等［17］。基因異常甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中是一種頻發(fā)的早期事件，其不但在組織中可被檢測(cè)到，在外周血、尿液、膽汁等體液中也能檢測(cè)到［18］，具有重要的臨床診斷和應(yīng)用價(jià)值。

表4 結(jié)直腸癌中ZIC1和KLOHTO甲基化與臨床病理特點(diǎn)Table 4 The correlation between ZIC1 and KLOTHO DNA methylation and clinicopathological features in colorectal cancers

本研究發(fā)現(xiàn)，ZIC1和KLOTHO基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)較癌旁組織明顯下調(diào);在結(jié)直腸癌組織中ZIC1和KLOTHO基因啟動(dòng)子普遍存在高甲基化現(xiàn)象，ZIC1甲基化陽(yáng)性率為80%(20/25)，KLOTHO甲基化陽(yáng)性率為76%(19/25)，聯(lián)合陽(yáng)性率達(dá)64%(16/25)。因此，我們推測(cè)ZIC1和KLOTHO的表達(dá)下調(diào)可能受到啟動(dòng)子高甲基化等表觀遺傳學(xué)調(diào)控。在部分結(jié)腸癌旁組織發(fā)生ZIC1和KLOTHO甲基化現(xiàn)象，其主要原因可能為:①這些組織在病理形態(tài)學(xué)上是正常的，但部分細(xì)胞在分子水平上已經(jīng)發(fā)生了甲基化，故癌旁組織實(shí)際上是相對(duì)正常組織;②甲基化特異性PCR(MSP)方法極度敏感，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后能發(fā)現(xiàn)0.1%比例甲基化DNA，癌旁組織出現(xiàn)較弱的甲基化(M)條帶。再者，甲基化可能是結(jié)腸癌發(fā)生的早期分子事件。本研究還觀察到KLOTHO mRNA表達(dá)與患者年齡間有相關(guān)性，尤以50歲以后年齡段，隨著年齡的遞增，KLOTHO mRNA表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，這可能與既往研究報(bào)道KLOTHO基因參與人類衰老過(guò)程相關(guān)［14］。

前期體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，ZIC1使胃癌細(xì)胞周期停滯，并抑制細(xì)胞增殖而發(fā)揮抑癌作用［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，KLOTHO基因在乳腺癌細(xì)胞中具有抑癌功能［15］，研究顯示 KLOTHO表達(dá)乳腺癌組織較正常組織明顯降低，過(guò)表達(dá)KLOTHO使乳腺癌細(xì)胞株MCF7和MDA-MB-231增殖抑制。有關(guān)ZIC1和KLOTHO在結(jié)直腸癌中是否具有腫瘤抑制作用值得進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

綜上，在結(jié)直腸癌組織中ZIC1和KLOTHO基因表達(dá)顯著下調(diào)，ZIC1和KLOTHO基因發(fā)生高頻率啟動(dòng)子甲基化，聯(lián)合檢測(cè) ZIC1和KLOTHO基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)對(duì)結(jié)直腸癌診斷具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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