線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體在缺血后處理中對心肌保護(hù)的作用

俞圖南，洪 浩，楊潔瓊，高 琴，夏 強(qiáng)

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院2004級(jí)七年制臨床醫(yī)學(xué)三系，浙江 杭州 310058;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，浙江 杭州 310058)

缺血后處理(ischemic postconditioning)是指在心肌長時(shí)程缺血后，于復(fù)灌初期立即給予心肌反復(fù)多次的短暫的復(fù)灌、停灌，是近年心肌保護(hù)方面研究的熱點(diǎn)之一。雖然缺血后處理的具體機(jī)制目前尚不完全清楚，但根據(jù)已有的研究，其涉及內(nèi)源性腺苷、NO的釋放、PI3kinase-Akt途徑、胞膜/線粒體通道的改變［1-2］。線粒體機(jī)制已成為研究心肌缺血/復(fù)灌損傷機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial ca1cium uniporter，MCU)是介導(dǎo)鈣離子從線粒體外進(jìn)入線粒體基質(zhì)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，對維持線粒體的鈣基質(zhì)穩(wěn)態(tài)有重要的作用［3］。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究，線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體在缺血預(yù)處理、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的心肌保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用［4-5］。據(jù)此，本研究假設(shè)缺血后處理保護(hù)作用與鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)，對線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體在缺血后處理中的作用了進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 試劑 3-［4，5-dimethylthiazol-2-y1］-2，5diphenyhetrazolium bromide(MTT)、精 胺(spermine，Sper)、釕紅(ruthenium red，RR)均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 離體心臟Langendorff灌流和左室功能評(píng)價(jià) 雄性Sprague-Dawley大鼠，體重230～260 g(浙江大學(xué)動(dòng)物中心提供)，處死后迅速取出心臟，置于4℃改良Krebs-Henseleit(K-H)液中洗凈血液，迅速轉(zhuǎn)移、固定于Langendorff灌流裝置，以改良K-H液行常規(guī)恒壓(76 mmHg)灌流。改良K-H液成分(mmol/L):NaCl 118.0、KCl 4.7、K2PO41.2、MgSO41.2、NaHCO325.0、CaC121.25、葡萄糖 10.0，pH 7.3 ～ 7.4，以95%O2+5%CO2飽和，灌流液溫度37℃。切開左心耳，將充水乳膠囊插入左心室，囊內(nèi)壓力經(jīng)特氟綸管傳遞至壓力傳感器，由MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄和分析。調(diào)節(jié)左心室內(nèi)乳膠囊內(nèi)水量，使左心室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)維持于4～8 mmHg，連續(xù)記錄左心室發(fā)展壓(1eft ventricular developed pressure，LVDP)、心 率(heart rate，HR)、心率與發(fā)展壓的乘積(ratepressure product，RPP)、左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximalrise/fallrateofleft ventricular pressure，±dP/dtmax)指標(biāo)。

1.3 缺血/復(fù)灌和缺血后處理的復(fù)制 本實(shí)驗(yàn)采用全心停灌的處理方法，以停止灌流30 min，恢復(fù)灌流120 min作為缺血/復(fù)灌過程。在停灌后復(fù)灌即刻立即給予6次全心停灌(10 s)/復(fù)灌(10 s)循環(huán)，共計(jì) 2 min［6］，實(shí)現(xiàn)缺血后處理。

1.4 在復(fù)灌各時(shí)間點(diǎn)收集冠脈流出液 采用分光光度法測定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的含量。

1.5 心肌formazan含量的測定 心臟從灌流裝置上取下后切成薄片(1～2 mm)，37℃水浴于1.25 g/L MTT中孵育30 min。取出心肌片，吸干其表面水分并稱濕重，按5 ml/g的量加入二甲基亞砜后勻漿，勻漿液離心(1000 ×g，10 min)，取上清液，測定其在550 nm處吸光度反映formazan的含量以觀察心肌細(xì)胞的活性情況。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，各組樣本來自同一批動(dòng)物。①缺血/復(fù)灌組(ischemia/reperfusion，I/R):心臟平衡 20 min后，全心停灌30 min，然后復(fù)灌120 min;②缺血后處理組(ischemic postconditioning，Postcond):同I/R組，但在復(fù)灌初期立即給予反復(fù)6次短暫的全心停灌(10 s)/復(fù)灌(10 s)的循環(huán)，共計(jì)2 min;③精胺+后處理組(Postcond+Sper):在復(fù)灌期的前10 min給予鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體激動(dòng)劑精胺(20 μmo/L)灌注，其余操作同缺血后處理組;④釕紅+后處理組(Postcond+RR):在復(fù)灌期的前10 min給予鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑釕紅(5 μmo/L)灌注，其余操作同缺血后處理組。

2 結(jié)果

2.1 缺血后處理對心肌缺血/復(fù)灌損傷有保護(hù)作用 缺血后處理組在復(fù)灌期間，RPP、±dP/dtmax均明顯高于I/R組(圖1、表1)。復(fù)灌采樣各時(shí)間點(diǎn)冠脈流出液中缺血后處理組LDH含量明顯低于I/R組(P＜0.01，表2)，反映心肌細(xì)胞活動(dòng)的心肌細(xì)胞formazan含量顯著高于I/R組(1.47 ±0.11 vs 1.29 ±0.06，P ＜0.01，圖2)，提示缺血后處理有心肌保護(hù)作用。

2.2 精胺減弱缺血后處理的保護(hù)作用 精胺+后處理組在復(fù)灌期間 RPP、LVDP、±dP/dtmax較缺血后處理組均明顯降低(圖1、表1);與缺血后處理組相比，精胺+后處理組顯著改變了復(fù)灌5 min時(shí)冠脈流出液LDH的釋放(40.37±3.28 vs 26.85±4.86，P ＜0.01，表2)和心肌細(xì)胞活度formazan含量(1.34±0.05 vs 1.47±0.11，P＜0.05，圖2)，提示精胺與后處理的聯(lián)合處理減弱了后處理對左心室動(dòng)力學(xué)功能的保護(hù)作用。

圖1 缺血后處理、精胺(20 μmol/L)和釕紅(5 μmol/L)對離體心臟復(fù)灌后各時(shí)間點(diǎn)心率與發(fā)展壓乘積的影響Fig.1 Effect of ischemic postconditioning，spermine(20 μmol/L)and ruthenium red(5 μmol/L)on rate-pressure product of the isolated hearts after reperfusion

圖2 缺血后處理、精胺(20 μmol/L)和釕紅(5 μmol/L)對離體心臟復(fù)灌120 min后心肌formazan含量的影響Fig.2 Effectofischemic postconditioning，spermine(20 μmol/L)and ruthenium red(5 μmol/L)on the content of formazan extracted from the isolated hearts after reperfusion of 120 min

表1 缺血后處理、精胺(20 μmol/L)和釕紅(5 μmol/L)對離體心臟復(fù)灌后各時(shí)間點(diǎn)左心室發(fā)展壓和左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率的影響Table 1 Effect of ischemic postconditioning，spermine(20 μmol/L)and ruthenium red(5 μmol/L)on left ventricular developed pressure and maximal rise/fall rate of left ventricular pressure of the isolated hearts after reperfusion(n=6，，缺血前%)

表1 缺血后處理、精胺(20 μmol/L)和釕紅(5 μmol/L)對離體心臟復(fù)灌后各時(shí)間點(diǎn)左心室發(fā)展壓和左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率的影響Table 1 Effect of ischemic postconditioning，spermine(20 μmol/L)and ruthenium red(5 μmol/L)on left ventricular developed pressure and maximal rise/fall rate of left ventricular pressure of the isolated hearts after reperfusion(n=6，，缺血前%)

與 I/R 組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 Postcond 組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

參 數(shù)復(fù)灌時(shí)間/min 30 60 90 120 LVDP I/R 79.88 ± 1.59 66.22 ± 4.12 38.12 ± 5.01 35.03 ± 1.63 Postcond 78.46 ± 9.36 69.24 ± 7.09 56.93 ± 2.68＊＊ 52.08 ± 5.84＊＊Postcond+Sper 77.53 ± 2.00 52.50 ±11.67# 43.88 ±14.16 45.31 ±10.96 Postcond+RR 74.89 ±13.66 66.04 ± 6.32 73.84 ± 6.53＊＊## 75.77 ±10.57＊＊##+dP/dtmax I/R 56.29 ± 6.53 54.80 ±10.71 46.43 ± 3.54 37.68 ± 2.42 Postcond 82.77 ±10.35＊＊ 71.28 ± 3.37* 61.70 ± 4.03* 55.28 ± 6.02＊＊Postcond+Sper 70.38 ± 3.23 47.46 ± 1.82## 43.74 ±10.56## 39.73 ±13.02#Postcond+RR 80.98 ±10.01＊＊ 71.93 ± 6.09* 83.07 ±16.54＊＊## 75.23 ±12.35＊＊##－dP/dtmax I/R 50.31 ±2.07 55.93 ± 6.04 47.69 ±4.37 44.71 ± 3.98 Postcond 69.42 ±6.26＊＊ 70.20 ± 4.60* 60.78 ±5.47* 54.41 ± 5.34 Postcond+Sper 58.84 ±4.46 52.93 ±10.48## 42.44 ±6.46## 41.04 ± 7.73#Postcond+RR 76.01 ±6.86＊＊ 69.01 ± 6.02* 85.75 ±2.47＊＊## 83.08 ±16.99＊＊##

表2 離體心臟復(fù)灌初期各時(shí)間點(diǎn)的灌流液中乳酸脫氫酶含量的變化Table 2 The changes of lactate dehydrogenase content in the coronary effluent of isolated hearts after reperfusion(n=6，，U·L－1)

表2 離體心臟復(fù)灌初期各時(shí)間點(diǎn)的灌流液中乳酸脫氫酶含量的變化Table 2 The changes of lactate dehydrogenase content in the coronary effluent of isolated hearts after reperfusion(n=6，，U·L－1)

與 I/R組比較，＊＊P ＜0.01;與 Postcond組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

組 別復(fù)灌時(shí)間/min 10 20 30 I/R 75.55 ±18.92 78.85 ±13.91 52.50 ±16.56 32.550 ±2.50 Postcond 26.85 ± 4.86＊＊ 15.75 ± 4.50＊＊ 10.95 ± 2.33＊＊ 12.00 ±8.00＊＊Postcond+Sper 40.37 ± 3.28＊＊## 22.45 ± 2.52＊＊ 18.14 ± 5.08＊＊ 14.26 ±3.20＊＊Postcond+RR 14.50 ± 6.54＊＊# 18.63 ± 6.48＊＊ 16.50 ± 3.25* 9.00 ±2.14＊＊

2.3 釕紅增強(qiáng)缺血后處理的保護(hù)作用 與I/R組相比，釕紅與后處理聯(lián)合應(yīng)用RPP、LVDP、±dp/dtmax均明顯增高(圖 1、表 1)，LDH 釋放減少(表2)，心肌細(xì)胞活度formazan含量增高(1.42±0.03 vs 1.29±0.06，P ＜0.05，圖2);同時(shí)，與缺血后處理組相比，其動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)明顯升高(表1)，復(fù)灌5 min時(shí)冠脈流出液LDH的釋放減少(14.50±6.54 vs 26.85±4.86，P＜0.05，表2)，提示釕紅和缺血后處理聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)一步增強(qiáng)后處理的保護(hù)作用。但心肌細(xì)胞活度formazan含量無明顯增加(1.42±0.03 vs 1.47±0.11，P ＞0.05，圖2)。

3 討論

離體心臟Langendorff灌流模型自1895年發(fā)明以來，就顯示出了其簡易、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在無附加處理的數(shù)小時(shí)內(nèi)離體心臟形態(tài)和功能基本保持穩(wěn)定，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)研究［7-9］。本實(shí)驗(yàn)在Langendorff灌流模型上研究線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體在心肌缺血后處理保護(hù)中的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血后處理可明顯減少大鼠離體心臟缺血/復(fù)灌后心肌細(xì)胞死亡，減少心肌損傷標(biāo)志酶LDH的漏出，改善灌注后左心室收縮功能。線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體開放劑精胺減弱了缺血后處理的心肌保護(hù)作用，提示缺血后處理的心肌保護(hù)作用可能與抑制鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示:鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑釕紅與后處理聯(lián)合應(yīng)用能增強(qiáng)后處理改善心室動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的作用和減少冠脈流出液LDH的釋放，提示后處理可能只是部分拮抗了線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體的活動(dòng)，釕紅抑制線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體開放可加強(qiáng)后處理的心肌保護(hù)作用。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，后處理減少了復(fù)氧初期氧自由基的大量產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化程度，同時(shí)降低了胞漿內(nèi)和線粒體內(nèi)Ca2+濃度而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷作用［10］。本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道，鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑釕紅可明顯減弱離體大鼠心臟缺血/復(fù)灌對心臟的損傷，減少氧自由基的釋放，其機(jī)制可能與釕紅和線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體上Ca2+低親和力位點(diǎn)結(jié)合，使其構(gòu)象改變，阻斷復(fù)灌過程中Ca2+過多進(jìn)入線粒體，減少線粒體鈣超載，從而減輕心肌細(xì)胞損傷有關(guān)［11］。精胺可以和線粒體S1與S2(主要是S1)精胺結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，通過構(gòu)象改變作用促進(jìn)胞漿內(nèi)的Ca2+向線粒體內(nèi)流，從而增加線粒體鈣超載，加重缺血/復(fù)灌損傷。本實(shí)驗(yàn)中線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體開放劑精胺減弱了缺血后處理的保護(hù)作用，推測可能是其通過增加線粒體鈣超載對抗后處理降低胞漿和線粒體內(nèi)鈣濃度增加的作用;而線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑釕紅增加后處理的保護(hù)作用可能是進(jìn)一步降低鈣超載而完成。其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，缺血后處理可能通過抑制線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體來實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用。

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