人過氧化氫酶基因重組腺病毒的構(gòu)建及其酶活性的測定

歐陽曉玲，李愛玲，寧啟蘭，楊旭東，許 楠，王慧蓮

(1.西安交通大學醫(yī)學院遺傳與分子生物學系，陜西 西安 710061;2.陜西教育學院生物科學與技術系，陜西 西安 710061;3.郴州市第一人民醫(yī)院，湖南 郴州 423000)

過氧化氫酶(catalase，CAT)是人體內(nèi)一類非常重要的抗氧化物酶，是H202的重要清除劑，其主要分布在過氧化物酶體中［1］。有人用脂質(zhì)體包埋的超氧化物歧化酶(SOD)和CAT通過靜脈注射的方式，使暴露于100%氧氣中的小鼠存活率明顯上升［2］。另外，Ruh等人也通過靜脈注射的方式將CAT用于非類固醇類消炎劑吲哚美辛誘導炎性腸胃道疾病的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的減輕炎癥區(qū)域的充血情況，起到抗炎作用［3］。本研究通過對含人CAT基因重組腺病毒載體的構(gòu)建、重組腺病毒的包裝、純化及鑒定該酶的活性，為進一步研究人CAT基因在基因治療中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、載體和菌株 限制性內(nèi)切酶EcoR V、Kpn I 和 Sal I，T4 DNA Ligation，pcDNA3.1+，DL 2000 均購自 TaKaRa公司。LR clonase II Enzyme mix，pENTR 1A 質(zhì)粒，pAd/CMV/V5-DEST和pAd/CMV/V5-LacZ載體，脂質(zhì)體2000 ，293A細胞系，感受態(tài)細胞DH5a和TOP10菌株均購自Invitrogen公司。

1.2 引物設計與合成 從GenBank數(shù)據(jù)庫里獲得人CAT基因的全長cDNA(NM 001752)，用Primer 5.0軟件設計。正向引物 P1:5'-AAAGGTACCGCTATGGCTGACAGCC-3'包含酶切位點Kpn I，反向引物P2:5'-TTTGATATCCA GATTTGCCTTCTCC-3'包含酶切位點EcoR V，由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

1.3 目的基因的制備和 pCDNA3.1+-CAT的構(gòu)建 從人血中分離白細胞，按RNA agent Total RNA isolation system試劑盒說明書指導提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR(94℃ 3 min，94℃ 45 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，35 個循環(huán);72℃5 min)擴增出CAT的目的基因片段。用Kpn I和EcoR V酶消化目的片段和pCDNA3.1+空載體，膠回收、連接和轉(zhuǎn)化后利用酶切和測序法鑒定陽性克隆。

1.4 含目的基因入門載體pENTR 1A-CAT的構(gòu)建 用Kpn I和EcoR V同時消化pcDNA3.1+-CAT和入門空載體pENTR 1A，經(jīng)膠回收、連接和轉(zhuǎn)化后，在含卡那霉素的LB瓊脂糖平板上篩選、挑取克隆、提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定。

1.5 含CAT基因重組腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-CAT的構(gòu)建 按照體外重組試劑盒LR clonase II Enzyme mix實驗指導，對含目的基因的載體pENTR 1A-CAT和腺病毒空載體pAd/CMV/V5-DEST進行體外同源重組實驗，挑取陽性克隆，利用DNA測序法確定目的基因序列是否整合在載體的正確位點上。

1.6 pAd/CMV/V5-DEST-CAT在293A細胞中包裝、擴增及滴度測定 將 Pac I線性化的pAd/CMV/V5-DEST-CAT與脂質(zhì)體2000 共轉(zhuǎn)染293A細胞，培養(yǎng)10 d后收集感染的293A細胞。經(jīng)反復凍融收集含病毒顆粒的細胞裂解液，再用100 μl該裂解液感染293A細胞進行病毒的擴增，2～3 d后可見90%細胞變圓，串珠狀脫落，反復凍融收集病毒，－80℃長期保存。用TCID50法測定第一代病毒滴度。

1.7 免疫印跡法檢測 pAd/CMV/V5-DESTCAT中CAT蛋白質(zhì)的表達 用RIPA蛋白提取試劑盒提取經(jīng)重組腺病毒pAd/CMV/V5-DEST-CAT感染293A細胞的蛋白，用BCA法定量蛋白，進行免疫印跡實驗。即以10%的SDS聚丙稀酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，再將蛋白轉(zhuǎn)移到polyscreen PVDF膜上，將PVDF膜浸在含0.1%Tween-20的 PBS(簡稱 TBS液)中1 h。然后，將膜放入初級抗體溶液中4℃孵育過夜，用TBS液洗2次后，再在二級抗體液中培養(yǎng)1.5 h，用TBS洗3次。用ECL檢測試劑盒檢測CAT蛋白條帶的免疫強度，并用ChemiImager成像系統(tǒng)采集實驗結(jié)果所得的圖像，再用相關的軟件(a-Innotech)對圖像中的免疫強度進行分析。

1.8 測定pAd/CMV/V5-DEST-CAT的CAT活性 在100 mm培養(yǎng)皿中種5×105個/L 293A細胞，用100 μl的病毒粗提液感染細胞，24 h后收集細胞，PBS洗2次。細胞在500 μl PBS中重懸，冰上用100%功率超聲破碎細胞15 min，得正常對照組、pAd/CMV/V5-LacZ感染組和pAd/CMV/V5-DEST-CAT感染組3組細胞裂解液。每組取3個5 ml的試管，分別標記為S1、S2(2個平行實驗組，分別加入0.2 ml細胞裂解液、1.5 ml pH 7.8 磷酸和 1.0 ml蒸餾水)和 S0(加入0.2 ml煮沸細胞裂解液，1.5 ml pH 7.8磷酸，1.0 ml蒸餾水)，每加 1 管時立刻計時，并迅速倒入石英比色皿中，在紫外分光光度計上測定各試管在240 nm下的光吸收值，每隔1 min讀數(shù)1次，共測4 min，重復測定3次。最后，依據(jù)公式△A240=AS0－(AS1+AS2)/2的值，繪制CAT活性曲線。過氧化氫酶活力單位定義為:每毫升細胞粗蛋白液每分鐘分解1 μmol H2O2的量為1個活力單位，按照公式(空白管吸光度－樣品管吸光度)×CAT分子量/反應時間/樣品中的蛋白毫克數(shù)。

1.9 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，在單因素方差分析的基礎上，用q檢驗-多重比較法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的獲得 RT-PCR法擴增出CAT基因的目的片段，所擴增出的片段與預期1585 bp大小相符(圖1)。

圖1 DNA凝膠電泳圖顯示RT-PCR的結(jié)果Fig.1 Diagram of DNA gel electrophoresis shows the result of RT-PCR

2.2 酶切和DNA測序鑒定 pcDNA3.1+-CAT陽性克隆 pcDNA3.1+-CAT陽性質(zhì)粒經(jīng)Kpn I和EcoR V雙酶切后，釋放出1586 bp目的基因片段和5385 bp的空載體片段(圖2)，可以確定目的基因已經(jīng)連接到該載體上。隨后陽性克隆基因測序的結(jié)果進一步確定，插入到載體pcDNA3.1+多克隆位點上的目的基因序列完全準確。

2.3 酶切法鑒定pENTR1A-CAT陽性克隆pENTR1A-CAT陽性質(zhì)粒經(jīng)Kpn I和EcoR V雙酶切后釋放出1586 bp目的基因片段和2253 bp的空載體片段，說明目的基因已成功地連接到入門載體上。pENTR1A-CAT陽性質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和EcoR V雙酶切后，SalⅠ的酶切位點在載體上，而EcoR V位點是目的基因連接位點;與經(jīng)Kpn I和EcoR V雙酶切釋放的片段之差十幾個堿基，但電泳結(jié)果幾乎相同，顯示目的基因插入的方向是正確的(圖3)。

圖2 pcDNA3.1+質(zhì)粒和質(zhì)粒酶切后的DNA凝膠電泳圖Fig.2 Diagram of DNA gel electrophoresis shows plasmid DNA of pcDNA3.1+and pcDNA3.1+-CAT/Kpn I+EcoR V

2.4 DNA序列測定法鑒定重組的pAd/CMV/V5-DEST-CAT載體 挑出pENTR 1A-CAT和腺病毒pAd/CMV/V5-DEST經(jīng)體外重組實驗(LR)反應后，再經(jīng)氨芐青霉素和氯霉素雙抗生素正負篩選，測序陽性克隆的基因，證實CAT基因如期整合到腺病毒載體pAd/CMV/V5-DEST的位點，且目的基因插入的方向正確，說

圖3 pENTR1A-CAT質(zhì)粒經(jīng)酶切后的DNA凝膠電泳圖Fig.3 Diagram of DNA gel electrophoresis shows plasmid DNA of pENTR1ACAT after digestion

圖4 293A細胞轉(zhuǎn)染7d后的細胞形態(tài)圖Fig.4 Morphology of cells after infection for 7 days

2.6 免疫印跡檢測重組pAd/CMV/V5-DESTCAT中目的蛋白質(zhì)的表達 含目的基因CAT的pAd/CMV/V5-DEST-CAT感染293A細胞24 h后，其目的蛋白過氧化氫酶在該細胞中得到了高表達(圖5)。

圖5 Western blot法檢測重組腺病毒轉(zhuǎn)染的293A細胞中CAT的表達Fig.5 Western blot analysis of 293A cells after pAd/CMV/V5-DEST-CAT infec-tion

2.7 Ad/CMV/V5-DEST-CAT的 CAT活性測定 圖6顯示:采用Ad-CAT、(A組)Ad-LacZ(B組)及PBS(C組)感染293A細胞24 h，其細胞蛋白提取液在1至4 min反應中CAT活性的變化。三組間CAT活性經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示:F=5.96，P ＜0.05。其中，A 組 4 min內(nèi)的酶活性分別比B組和C組高出(63.8±1.54)% 和(76.7 ±1.67)%(P ＜0.05)，而B組和C組的平均酶活性無顯著性差異(P＞0.05)。這說明被Ad-CAT重組腺病毒感染的293A細胞裂解液中含有較強的CAT活性。

圖6 CAT活性測定曲線圖Fig.6 Diagram ofactivity determination for catalase

3 討論

目前大量的臨床資料和基礎研究表明，人類癌癥、衰老、肥胖、各種炎癥以及自身免疫性疾病等多種疾病的產(chǎn)生與自由基有關。CAT是人體內(nèi)非常重要的一類抗氧化物酶，許多實驗結(jié)果表明CAT在抗氧化損傷引起的各種疾病的治療上具有重要意義。Roscoe等人在免疫復合物誘導急性肺損傷的大鼠模型中注射牛肝CAT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能明顯地減少炎癥反應中嗜中性白血球及減輕肺泡的損傷，具有抗急性氧化損傷的作用［5］。Joanne等研究證明，CAT在細胞模型中能逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細胞株的致瘤性［6］。本研究利用通路克隆系統(tǒng)高效、準確地構(gòu)建了含人抗氧化物酶基因的重組腺病毒表達載體，并且獲得了高滴度和高純度的含人CAT基因重組腺病毒株。為進一步揭示氧化應激在一些疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制和對一些疾病的基因治療的研究打下了堅實的基礎。

目前用于基因治療的病毒載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、單純皰疹病毒載體等;其中，以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及腺病毒載體最常用。腺病毒載體由于具有宿主細胞廣泛、可感染靜止及分裂期細胞、繁殖滴度高、性質(zhì)穩(wěn)定、包裝容量大及不整合等優(yōu)點，而被廣泛應用的在基因治療中，尤其是用于體內(nèi)基因的治療研究。

本研究采用基于attL X attR的λ噬茵體位點特異性重組系統(tǒng)的Gateway TM技術［4］，在高效重組酶作用下體外進行同源重組，形成重組腺病毒表達載體。從而避免了繁雜的篩選和鑒定過程，節(jié)約了大量的人力、物力和財力。

［1］ANISIMOV V N，ZAVARZAIN N.Melatonin increases both life span and tumor incidence in female CBA mice［J］.J Gerontol A Bioi Sci Med Sci，2001，56(7):B311-B323.

［2］TURRENS J F，CRAPO J D，F(xiàn)REEMAN B A.Protection against oxygen toxicity by intravenous injection of liposome-entrapped catalase and superoxide dismutase［J］.J Clin Invest，1984，73:87-95.

［3］RUH J，VOGEL F，SCHMIDT E，et al.Effects of hydrogen peroxide scavenger catalase on villous microcirculation in the rat small intestine in a model of inflammatory bowel disease ［J］.Microvascular Research，2000，59(3):329-337.

［4］WANG Zong-gui，ZHENG Wen-ling，MA Wen-li(汪宗桂，鄭文嶺，馬文麗).Gateway cloning system:recentadvanceofDNA recombination technology［J］.Journa of China Biotechnology(中國生物工程雜志)，2003:23(7):24-27.(in Chinese)

［5］ROSCOE L.Time-dependent inhibition of immune complex-induced lung injury catalase:relationship to alterations in macrophage and neutrophil matrix metalloproteinase elaboration ［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2000，29(1):8-16.

［6］JOANNE S F，Margaret E T，Kevin A K，et al.Catalase reverses tumori-genicity in a malignant cell line by an epidermal growth factor receptor pathway［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2006，40:863-875.