星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化大承氣湯中和厚樸酚與厚樸酚的提取工藝

謝 臻， 曹 騁， 曾元兒， 江 濱＊

(1.廣西中醫(yī)學(xué)院藥物分析教研室，廣西 南寧 530001;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析教研室，廣東 廣州 510006)

大承氣湯主治傷寒、溫病或瘟疫陽明腑實(shí)，為瀉法的代表湯劑。其傳統(tǒng)煎法為“先煎枳、樸，后下大黃，納芒硝，溶化服”。但目前已發(fā)現(xiàn)，在藥味組成、劑量配比完全相同的情況下，以不同煎法制成的大承氣湯藥效差異甚大［1-2］。因此，研究大承氣湯的最佳提取條件，可為其復(fù)方配伍研究和質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

數(shù)學(xué)模型在藥學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛，特別是在工藝的優(yōu)化上，體現(xiàn)了應(yīng)用數(shù)學(xué)模型的優(yōu)勢。星點(diǎn)設(shè)計(jì)在處方、方法和工藝的篩選與優(yōu)化方面有著廣泛的應(yīng)用［3-8］。本實(shí)驗(yàn)旨在采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選法對(duì)大承氣湯中和厚樸酚與厚樸酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為大承氣湯中有效成分的提取提供依據(jù)，同時(shí)也為探討該法應(yīng)用于傳統(tǒng)方劑提取工藝的可行性提供依據(jù)。

1 儀器與材料

LC-10AT高效液相色譜儀(日本島津儀器有限公司);N2010色譜工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司);AEG-220電子分析天平(日本島津儀器有限公司);

大黃、厚樸、枳實(shí)、芒硝飲片購于廣州致信中藥飲片有限公司，均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃海波副教授鑒定。和厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110730-200408);厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110729-200310)，均購于中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸膏提取

按處方比例(大黃12 g、厚樸24 g、枳實(shí)12 g、芒硝9 g)的1/10，取枳實(shí)、厚樸，精密稱定，按星點(diǎn)設(shè)計(jì)矩陣安排試驗(yàn)的提取條件，加熱回流，濾過，藥液中按處方比例加入大黃藥材(精密稱定)，再加熱回流，濾過，向藥液中溶入芒硝(精密稱定)，微沸5 min，趁熱濾過，提取藥液經(jīng)減壓濃縮干燥，得干浸膏粉，備用。

2.2 色譜條件［9］

色譜柱C18柱(大連依利特分析儀器有限公司，Hypersil ODS2 5 μm，4.6 mm ×250 mm);流動(dòng)相甲醇-水(78 ∶22);體積流量1 mL/min;柱溫30℃;檢測波長294 nm;進(jìn)樣量5 μL。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取厚樸酚對(duì)照品、和厚樸酚對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1mL含和厚樸酚0.12 mg、厚樸酚0.165 mg的溶液，搖勻，即得。

2.4 供試品溶液制備

取大承氣湯干膏0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，搖勻，密塞，浸漬24 h，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察

按上述色譜條件，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品量X(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得和厚樸酚與厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=259 340 2X－1 630.740 3，r=0.999 8;Y=3 950 803X－6 594.143 5，r=0.999 8;線性范圍分別為 0.012 ～0.30 μg，0.033 ～0.825 μg。

2.6 預(yù)試驗(yàn)選擇提取因素及相關(guān)水平

2.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍的選擇 比較了以水，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%和95%乙醇作為提取溶劑對(duì)和厚樸酚與厚樸酚提取率的影響。結(jié)果以水溶劑時(shí)其提取率偏低，以50%和95%乙醇為溶劑時(shí)提取率較高，但芒硝在70%，80%和95%乙醇中難以溶解，而且預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芒硝會(huì)對(duì)全方的成分溶出等產(chǎn)生影響，所以沒有考慮將乙醇提取液縮、降低乙醇濃度后再加入芒硝。最后選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)上限為60%，下限為20%。

2.6.2 提取時(shí)間的選擇 比較提取時(shí)間為30、40、50、60、90和120 min對(duì)和厚樸酚與厚樸酚提取率的影響。結(jié)果表明提取90 min后，各提取率變化不大，所以選擇提取時(shí)間范圍為30～90 min。

2.6.3 提取次數(shù)與溶媒比范圍的選擇 提取次數(shù)一般為3次，但由于大承氣湯的煎煮過程中大黃和芒硝需要后下，為了便于比較，本實(shí)驗(yàn)選擇提取1次。比較了溶媒比為13、18、22、25倍量對(duì)和厚樸酚與厚樸酚提取率的影響，結(jié)果以溶媒比為22倍量時(shí)和厚樸酚與厚樸酚提取率較高，但考慮到提取成本，所以在選擇溶媒比范圍時(shí)把下限定為10倍量，上限定為25倍量。

2.7 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

每個(gè)因素按星點(diǎn)設(shè)計(jì)矩陣選擇的各水平及其對(duì)應(yīng)的編碼值見表1～2。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.7.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 按處方比例精密稱取枳實(shí) 1.2 g、厚樸 2.4 g、大黃 1.2 g，芒硝 0.9 g，按表 2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)矩陣安排試驗(yàn)。

取乙醇體積分?jǐn)?shù)百分?jǐn)?shù)(X1)、提取時(shí)間(X2)、溶媒比(X3)3個(gè)因素作處變量，以和厚樸酚與厚樸酚總提取百分含量(Y，和厚樸酚與厚樸酚質(zhì)量總和/厚樸藥材質(zhì)量×100%)作因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)的方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，多元線性擬合模型Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3，二項(xiàng)式擬合模型:Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X12+b5X22+b6X32+b7X1X2+b8X1X3+b9X2X3。

2.7.2 模型擬合 以和厚樸酚與厚樸酚提取率為因變量，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式按擬合，以方程的P＜0.05作為顯著標(biāo)準(zhǔn)，選擇有較大r值的模型，對(duì)方程進(jìn)

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.947 45，相對(duì)多元線性擬合有提高，表明該方程有較大可信度，預(yù)測性較好。

2.7.3 工藝優(yōu)化和預(yù)測 繪制響應(yīng)曲面及其等高線圖，見圖1～3。應(yīng)用 LINGO9.0軟件求導(dǎo)，可得:當(dāng)提取條件為60%乙醇、提取時(shí)間為90 min，溶媒比為19.92倍時(shí)，Y有預(yù)測的最大值4.62%。本實(shí)驗(yàn)最終選取大承氣湯的最佳提取工藝條件為60%乙醇、提取時(shí)間為90 min，溶媒比為19.92倍。

2.7.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)最佳工藝條件再提取大承氣湯3份，結(jié)果與擬合方程預(yù)測的最大值比較，偏差=(預(yù)測值－實(shí)測值)/預(yù)測值×100%，結(jié)果見表3。行優(yōu)化，得多元線性方程:

二項(xiàng)式方程:

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 討論

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的響應(yīng)曲面及其等高線圖

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)和溶媒比的響應(yīng)曲面及其等高線圖

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法是適宜進(jìn)行非線性擬合的優(yōu)化法，通常在最佳條件附近，指標(biāo)與影響因素之間的關(guān)系為非線性，此時(shí)不宜用線性方程進(jìn)行擬合，應(yīng)選用二次多項(xiàng)式或更高次的多項(xiàng)式進(jìn)行擬合以得到最佳的模型擬合度。本實(shí)驗(yàn)中二項(xiàng)式模型的擬合相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.947 45，模型可信度較高，通過預(yù)測分析也證實(shí)所建立的數(shù)學(xué)模型具有極佳的預(yù)測性。

本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法得出了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溶媒比對(duì)大承氣湯中和厚樸酚與厚樸酚提取率的效應(yīng)趨勢，優(yōu)化了大承氣湯的提取工藝條件。從對(duì)本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所繪制的曲面圖可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間對(duì)考察指標(biāo)的影響較大，而溶媒比對(duì)考察指標(biāo)的影響相對(duì)較小。按實(shí)驗(yàn)所得的最佳提取條件測定和厚樸酚與厚樸酚總含量的提取轉(zhuǎn)移率為89.44% ～94.33%。實(shí)驗(yàn)存在的問題，如在實(shí)際大生產(chǎn)中，需要考慮到大黃如何后下的，在以后的中試實(shí)驗(yàn)中要進(jìn)一步研究。

圖3 提取時(shí)間和溶媒比的響應(yīng)曲面及其等高線圖

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