大孔樹脂對(duì)金藍(lán)膠囊提取液的分離純化工藝研究

盛華剛， 朱立俏， 林桂濤

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355)

金藍(lán)膠囊由金蕎麥、沙棘、絞股藍(lán)和腫節(jié)風(fēng)組成，具有清熱解毒護(hù)陰，涼血活血止咳的功效，對(duì)肺癌具有較好的療效，現(xiàn)將其研制成新藥。在金藍(lán)膠囊的提取工藝研究中［1］，金蕎麥單獨(dú)提取，沙棘、絞股藍(lán)、腫節(jié)風(fēng)三味藥材合并提取。對(duì)金蕎麥提取液采用大孔樹脂分離純化已進(jìn)行了研究，取得了較好的效果［2］。大孔樹脂對(duì)單味藥的純化研究較多，對(duì)于復(fù)方制劑的研究較少，其純化應(yīng)采用多成分指標(biāo)進(jìn)行研究［3-7］。本試驗(yàn)以沙棘、絞股藍(lán)、腫節(jié)風(fēng)三味藥材提取液中沙棘和腫節(jié)風(fēng)中所含的總黃酮、絞股藍(lán)中的絞股藍(lán)皂苷、腫節(jié)風(fēng)中的異秦皮啶為指標(biāo)，進(jìn)行大孔樹脂純化研究，從而為大孔樹脂用于中藥復(fù)方制劑的純化提供參考。

1 儀器、材料與藥材

LC-10A高效液相色譜儀(日本島津)，UV-754分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。蘆丁對(duì)照品(100080-200306)，人參皂苷Rb1對(duì)照品(110704-200318)，異秦皮啶對(duì)照品(0837-200203)均購自中國藥品生物制品檢定所;所用試劑中乙腈為色譜純，其它為分析純;D-101、DA-201、DM-301大孔樹脂(天津海光化工有限公司)。沙棘、絞股藍(lán)、腫節(jié)風(fēng)藥材購于濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液和上樣藥液的制備

沙棘、絞股藍(lán)、腫節(jié)風(fēng)三味藥材加70%乙醇，加熱回流提取2次，第1次加12倍量，第2次加8倍量，每次提取3 h，濾液回收乙醇，濃縮，加水定容至濃度為0.3 g生藥/mL，作為提取液。提取液以2 500 r/min離心10 min，收集離心液，沉淀加少量熱水混懸，再次離心，合并兩次離心液，調(diào)整濃度為0.3 g生藥/mL，作為上樣藥液。

2.2 大孔樹脂的預(yù)處理

試驗(yàn)所采用的樹脂皆是醫(yī)藥級(jí)樹脂，不需用酸堿進(jìn)行前處理，只需用95%乙醇浸泡至充分溶脹，再用蒸餾水沖洗至無醇味即可使用。

2.3 提取液和上樣藥液的成分測(cè)定［1］

2.3.1 總黃酮測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取蘆丁對(duì)照品10.18 mg，置25 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度。精密吸取 0.25，0.75，1.5，3.0，6.0 mL 分別置 25 mL 量瓶中，加無水乙醇至6.0 mL，搖勻，分別加入1.0 mL 5% 亞硝酸鈉溶液，混勻，放置6 min，加入1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，放置6 min，加入10.0 mL 10%NaOH 溶液，混勻，放置 15 min，加水至刻度，于500 nm處測(cè)定吸收度。回歸方程為Y=－0.003 51+0.011 15X(r=0.999 9)，蘆丁在 0.102 ～2.436 mg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

供試品溶液中總黃酮的測(cè)定:精密吸取供試品溶液10 mL，通過聚酰胺柱(50 ～80 目，2.5 g，ф1.5 cm)，先用 100 mL水洗脫，再用100 mL無水乙醇洗脫，收集無水乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)脽o水乙醇定容至10 mL。精密吸取0.5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作測(cè)定含量。結(jié)果見表1。

2.3.2 絞股藍(lán)皂苷測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品2.03 mg置1 mL量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取10，20，40，60，80，100 μl分別置 5 mL 量瓶中，熱風(fēng)揮去溶劑，加0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，60℃水浴加熱15 min，取出，迅速用冷水冷卻，冰醋酸定容至刻度，放置30 min，于550 nm處測(cè)定吸收度?；貧w方程為Y=0.008 18+0.021 18X(r=0.9993)，人參皂苷 Rb1在 4.06～40.6 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

供試品溶液中絞股藍(lán)皂苷的測(cè)定:精密吸取供試品溶液10 mL，用乙醚提取至乙醚層無色，水層用同體積水飽和正丁醇提取6次，合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，通過D-101大孔樹脂柱(1.5 cm×13 cm)，先用100 mL水洗脫，繼用100 mL 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL。精密吸取50 μL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作測(cè)定含量。結(jié)果見表1。

2.3.3 異秦皮啶含量測(cè)定 色譜條件:Kromasil C18色譜柱(5 μm、4.6 mm ×200 mm);流動(dòng)相為乙腈 －0.1%磷酸溶液(20∶80);檢測(cè)波長(zhǎng)為344 nm;體積流量為1.0 mL/min;溫度為室溫。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取異秦皮啶對(duì)照品1.01 mg置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度。精密吸取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，各吸取20 μl進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程為Y=2 156+1 995 550X(r=0.999 9)，異秦皮啶在0.0404 ～0.404 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

供試品溶液中異秦皮啶的測(cè)定:精密吸取供試品溶液5 mL，用三氯甲烷提取5次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?0 mL，搖勻，注入液相色譜儀，測(cè)定含量。結(jié)果見表1。

表1 提取液和上樣藥液有效成分分析

2.4 大孔樹脂型號(hào)的確定

取D-101、DA-201、DM-301 3種型號(hào)的大孔樹脂各18 mL裝柱(ф1.5 cm ×10.5 cm)，量取 100 mL 上樣藥液通過樹脂柱，收集流出液;先用100 mL水洗脫，收集水洗脫液;再用100 mL 70%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，上柱體積流量和洗脫體積流量控制為0.5 mL/min。按2.3項(xiàng)下的方法測(cè)定流出液、水洗脫液和乙醇洗脫液中有效成分的量，計(jì)算3種型號(hào)樹脂的比吸附量和洗脫率。結(jié)果見表2。

表2 3種型號(hào)樹脂比吸附量和洗脫率比較

由表2可以看出，D-101大孔樹脂對(duì)總黃酮、絞股藍(lán)皂苷、異秦皮啶均有較好的吸附和洗脫效果，因此采用D-101大孔樹脂進(jìn)行純化。

2.5 上樣工藝的研究

采用大孔樹脂純化過程中，藥液濃度、體積流量、pH值等因素會(huì)對(duì)成分的吸附產(chǎn)生影響［8］，無機(jī)鹽濃度會(huì)對(duì)總皂苷的吸附存在影響［9］，甚至是影響總皂苷大孔樹脂比吸附量的重要因素［10］，所以將無機(jī)鹽濃度也列為考察因素之一。因素水平見表3。

2.5.1 試驗(yàn)方法 量取濃度為0.15 g生藥/mL的藥液160 mL，0.30 g生藥/mL 的藥液 80 mL，0.60 g生藥/mL 的藥液40 mL，通過 D-101 大孔樹脂柱(ф1.5 cm ×10.5 cm)，各因素水平按正交表中的設(shè)計(jì)操作，收集流出液;用100 mL水洗脫，體積流量為2 BV/h，收集水洗脫液。測(cè)定流出液、水洗脫液中有效成分的含量，以有效成分的比吸附量為指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法優(yōu)選最佳上樣工藝。結(jié)果見表4。方差分析見表5。

表3 上樣工藝考察因素及水平

表4 上樣工藝考察L9(34)正交試驗(yàn)

表5 方差分析

由結(jié)果可以看出:對(duì)有效成分比吸附量的影響因素依次排列為 C＞B＞D＞A，直觀分析的最佳上樣工藝為A3B1C1D1，但A因素中二、三水平相差不大，且三水平是由二水平濃縮制得，在濃縮的過程中會(huì)有少量沉淀產(chǎn)生，如再次離心會(huì)造成成分損失，直接上柱會(huì)影響流速，增加流速的控制難度。綜合以上分析，確定最佳上樣工藝為A2B1C1D1。即上樣藥液濃度為0.3 g生藥/mL，體積流量為2 BV/h，pH值為5.0，不加無機(jī)鹽。

2.5.2 上樣工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 最佳上樣工藝試驗(yàn)3次，結(jié)果總黃酮比吸附量為(6.85±0.45)mg/mL樹脂，絞股藍(lán)皂苷比吸附量為(18.44±0.12)mg/mL樹脂，異秦皮啶比吸附量為(359±3)μg/mL樹脂，說明最佳上樣工藝是可行的。通過驗(yàn)證試驗(yàn)可以確定上樣量與大孔樹脂量比例為總黃酮≤6.8 mg/mL樹脂，絞股藍(lán)皂苷≤18 mg/mL樹脂，異秦皮啶≤350 μg/mL樹脂。為了保證成分的有效吸附，防止泄漏現(xiàn)象的發(fā)生，依據(jù)上樣藥液中的有效成分含量，初步確定藥液上樣量為70 mL并對(duì)此進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果有效成分未發(fā)生泄漏。

2.6 洗脫溶劑濃度的考察

取D-101 大孔樹脂18 mL(1.5 cm ×10.5 cm)，上樣藥液70 mL上柱，用100 mL水洗脫后分別采用30%、50%、70%、90%乙醇各150 mL洗脫，上柱和洗脫液體積流量皆為2 BV/h，收集乙醇洗脫液，測(cè)定有效成分，計(jì)算洗脫率。繪制不同乙醇濃度對(duì)有效成分洗脫率的曲線圖，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，絞股藍(lán)皂苷洗脫率明顯增大，而總黃酮和異秦皮啶洗脫率增加很小。采用30%乙醇洗脫時(shí)，總黃酮洗脫率為88.03%，異秦皮啶洗脫率為93.95%，增加乙醇濃度對(duì)洗脫率影響很小;30%乙醇對(duì)絞股藍(lán)皂苷洗脫率為45.63%，隨著乙醇濃度的增加，洗脫率也增加，70%乙醇洗脫率為92.40%，再增加乙醇濃度，洗脫率幾乎不增加，該濃度與文獻(xiàn)［11］報(bào)道一致。綜合考慮各成分洗脫率和生產(chǎn)成本，洗脫溶劑確定為70%乙醇。

圖1 乙醇濃度對(duì)洗脫率的影響

2.7 洗脫溶劑用量的考察

上樣藥液上柱同2.6項(xiàng)下方法，先用100 mL水洗脫，繼以150 mL 70%乙醇洗脫，洗脫液體積流量為2 BV/h，洗脫液每25 mL收集1次。分別測(cè)定水洗脫液中浸膏量和70%乙醇洗脫液中有效成分含量。結(jié)果表明用水量達(dá)到75 mL(約為樹脂體積的4倍)時(shí)洗脫液中固形物已經(jīng)很少，故水的用量確定為樹脂體積的4倍;70%乙醇用量達(dá)到100 mL(約為樹脂體積的6倍)時(shí)，洗脫液中有效成分已呈微量，所以70%乙醇的用量確定為樹脂體積的6倍。

2.8 大孔樹脂純化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

上樣藥液上柱同2.6項(xiàng)下方法，先以樹脂體積4倍量的水洗脫，繼以樹脂體積6倍量的70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，洗脫液流速為2 BV/h，測(cè)定純化前后干膏率及有效成分含量，計(jì)算純化前后干膏中有效成分含量和純化后有效成分收率。結(jié)果見表6。

表6 純化前后比較和有效成分收率(n=3)

由表6可知:(1)三藥合提藥液純化后干膏率為純化前的16.61%，經(jīng)過大孔樹脂純化后干膏率明顯下降;(2)純化后干膏中有效成分含量明顯提高且有較高的收率，有效成分損失較少。試驗(yàn)說明D-101大孔樹脂對(duì)金藍(lán)膠囊提取液中的總黃酮、絞股藍(lán)皂苷、異秦皮啶皆有較好的純化作用，所確定的純化工藝是合理的。

3 討論

3.1 影響大孔樹脂純化效果的因素有很多，如大孔樹脂的結(jié)構(gòu)、被純化成分的性質(zhì)、上柱前藥液的理化性質(zhì)(包括藥液的濃度、溫度、酸堿度、無機(jī)鹽濃度、黏度等)、吸附時(shí)的溫度、上柱及洗脫時(shí)的體積流量、洗脫劑的種類及用量、樹脂柱的徑高比等。試驗(yàn)中僅對(duì)部分影響因素進(jìn)行了考察，其它因素有待于以后進(jìn)一步研究。

3.2 大孔樹脂能富集、分離不同母核結(jié)構(gòu)的藥物，可用于單味藥材或復(fù)方制劑中有效成分的分離與純化，但大孔樹脂型號(hào)眾多，性能用途各異，而中藥成分又極其復(fù)雜，尤其是復(fù)方制劑，首先應(yīng)根據(jù)功能主治明確其有效成分的類別和性質(zhì)，再通過試驗(yàn)確定對(duì)各有效成分皆具有較好吸附和洗脫能力的大孔樹脂。

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