大孔吸附樹脂富集純化竹節(jié)參總皂苷工藝條件優(yōu)選

歐陽(yáng)麗娜， 吳 雪， 李蘭林， 孫曉博， 向大雄*

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院天然藥物研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2.岳陽(yáng)市一人民醫(yī)院藥劑科，湖南 岳陽(yáng)414000；3.北京市積水潭醫(yī)院，北京， 100035）

大孔吸附樹脂富集純化竹節(jié)參總皂苷工藝條件優(yōu)選

歐陽(yáng)麗娜1，2， 吳 雪1，3， 李蘭林1， 孫曉博1， 向大雄1*

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院天然藥物研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2.岳陽(yáng)市一人民醫(yī)院藥劑科，湖南 岳陽(yáng)414000；3.北京市積水潭醫(yī)院，北京， 100035）

目的 研究大孔吸附樹脂富集純化竹節(jié)參中總皂苷的工藝條件及參數(shù)。方法 以竹節(jié)參總皂苷的吸附量和洗脫率為指標(biāo)，篩選大孔吸附樹脂，并研究所選樹脂富集純化竹節(jié)參總皂苷的吸附和洗脫條件。結(jié)果 D101樹脂對(duì)竹節(jié)參總皂苷有較好的吸附分離性能。最佳工藝條件為上樣質(zhì)量濃度為0.2 g生藥/mL，以3BV 70%乙醇溶液洗脫，吸附及洗脫體積流量均為1 mL/min，洗脫液蒸干，即得純化的竹節(jié)參總皂苷提取物。純化后竹節(jié)參總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82.53%，精制度達(dá)338.81%。結(jié)論 D101大孔吸附樹脂富集純化竹節(jié)參中總皂苷是可行的。

竹節(jié)參；總皂苷；大孔吸附樹脂；純化

竹節(jié)參Panacis japonici Rhizoma為五加科Araliaceae植物竹節(jié)參Panax japonicusC.A.Mey.的干燥呈竹鞭狀根莖，廣泛分布于日本及中國(guó)西南至中部地區(qū)［1］。其性溫、味甘、微苦，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、散瘀止痛、止血祛痰等功效［2］，兼具我國(guó)北藥人參和南藥三七的功用，享有“土家族神參”的美譽(yù)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，竹節(jié)參中研究最多、功效最顯著的為皂苷類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤以及降血糖等藥理活性［3-6］，因此，加強(qiáng)對(duì)其開發(fā)與利用具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

大孔吸附樹脂（Macro Absorption Resin）為一種選擇性有機(jī)高聚吸附劑，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離與富集，尤其適用于水溶性化合物，如皂苷、黃酮及生物堿等的分離與富集，但在竹節(jié)參總皂苷（Total saponins ofPanax japonicusC.A.Mey.，TsPJ）純化工藝方面尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討大孔吸附樹脂富集、純化竹節(jié)參總皂苷的工藝條件和參數(shù)，從而確立富集、純化竹節(jié)參總皂苷的可行方法，為其開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料及儀器

竹節(jié)參藥材（購(gòu)于湖北恩施圣豐藥業(yè)）；人參皂苷Re對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為754-9204）；乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸均為分析純，水為雙蒸水。

HPD-100型大孔樹脂購(gòu)自滄州寶恩大孔樹脂有限公司；D101、AB-8、LX-68型大孔樹脂購(gòu)自西安藍(lán)曉科技有限公司；S-8型大孔樹脂購(gòu)自南開和成科技有限公司。

SPECORD50型紫外-可見分光光度計(jì)（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司），恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠），分析天平（METTLER公司），RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），NJL07-3型微波提取器（南京杰全微波設(shè)備有限公司），YB-Z真空恒溫干燥箱（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 竹節(jié)參總皂苷的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［7-8］

精密稱定人參皂苷Re對(duì)照品4.59 mg，加甲醇溶解，定容至5 mL，得0.918 mg/mL的對(duì)照品溶液。

用20～200 μL可調(diào)微量取樣器吸取制備好的人參皂苷 Re 標(biāo)準(zhǔn)溶液 40、80、120、160、200 μL 于10 mL具塞試管中，70℃水浴蒸干，于每個(gè)試管中加新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，置 60 ℃水浴上加熱15 min，流水冷卻，準(zhǔn)確加入冰醋酸5 mL，搖勻，以分光光度計(jì)在552 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值（A）。以吸光度值（X）為橫坐標(biāo)，以人參皂苷Re的量（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.272 3X+0.001 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，表明人參皂苷 Re在 55.08 ～219.44 μg與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.1.2 樣品液的制備與總皂苷的測(cè)定

取竹節(jié)參藥材粉末1 000 g，預(yù)先浸漬12 h，以80%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶18，功率為300 W提取4次，每次5 min，趁熱過(guò)濾，合并提取液，回收乙醇。向提取液中加入適量活性炭，使其濃度達(dá)到1%左右，加熱并保持75℃，磁力攪拌30 min進(jìn)行脫色處理，趁熱過(guò)濾，將濾液用蒸餾水定容至5 000 mL作為儲(chǔ)備上樣液（0.2 g生藥/mL），放置冰箱冷藏。

精密吸取竹節(jié)參樣品液5 mL，用水飽和正丁醇萃取3次，每次5 mL，合并正丁醇層，水浴揮干，甲醇溶解并定容至50 mL，精密吸取上述溶液50 μL，按2.1.1項(xiàng)下操作，測(cè)定吸收值，計(jì)算總皂苷量，結(jié)果平均為 24.32 mg/mL，RSD 為 2.54%（n=6）。

2.2 大孔樹脂型號(hào)選擇

取預(yù)處理好的濕樹脂抽濾，除去水分后，精確稱取5.00 g，置于具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入用貯備液稀釋所得竹節(jié)參總皂苷樣品溶液（0.1 g生藥/mL）50 mL，室溫放置，每隔10 min振搖1次，持續(xù)4 h，使樹脂充分吸附TsPJ，過(guò)濾，測(cè)定濾液中TsPJ濃度，計(jì)算各種樹脂的靜態(tài)飽和吸附量。同時(shí)將吸附飽和的樹脂濾除水分，放入具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL 95% 的乙醇，室溫放置，每隔10 min振搖1次，持續(xù)4 h，使TsPJ充分解析，過(guò)濾，測(cè)定濾液中TsPJ濃度，并計(jì)算各種樹脂的靜態(tài)解析率，結(jié)果見表1。

雖然S-8型大孔樹脂靜態(tài)吸附量較D101型大孔樹脂大，但解析率卻不及后者；相比于其它類型大孔吸附樹脂，D101樹脂對(duì)TsPJ有著相對(duì)較高靜態(tài)吸附量和靜態(tài)解析率，故選擇D101大孔樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附-洗脫性能的研究。

表1 不同樹脂靜態(tài)吸附量和解析率的比較Tab.1 Adsorption and desorption of iridoid with different marcroporous resin

2.3 D101型大孔吸附樹脂對(duì)TsPJ動(dòng)態(tài)吸附洗脫參數(shù)考察

2.3.1 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附的影響

精確稱取20.00 g已處理好的樹脂裝柱，徑高比約1∶10。分別配制一系列不同質(zhì)量濃度的竹節(jié)參總皂苷樣品溶液，將之以不同的體積分別加到樹脂柱中，收集過(guò)柱殘液和水洗液，測(cè)定其中皂苷的量，計(jì)算比吸附量，結(jié)果見表2，確定最佳上樣質(zhì)量濃度為0.2 g生藥/mL。

表2 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)比吸附量的影響 （n=3）Tab.2 The effect of concentration of feed on adsorption amount

2.3.2 吸附流量對(duì)吸附容量的影響

精確稱取20.00 g已處理好的樹脂裝柱，徑高比約1∶10。分別控制不同上樣流量，收集過(guò)柱殘液和水洗液，并測(cè)定其中皂苷的量，計(jì)算比吸附量，結(jié)果見表3。確定樣液的最佳吸附流速為1 mL/min。

表3 吸附流量對(duì)比吸附量的影響 （n=3）Tab.3 The effect of feed rate on adsorption amount（n=3）

2.3.3 上樣液pH值對(duì)吸附的影響

精確稱取20.00 g已處理好的樹脂裝柱，徑高比約1 ∶10。上樣液的 pH 值分別調(diào)為 4、5、6、7、8，收集過(guò)柱殘液和水洗液，測(cè)定其中皂苷的質(zhì)量濃度，計(jì)算比吸附量，結(jié)果見表4。三萜皂苷作為一種弱酸性化合物，在弱酸性溶液中以分子形式存在，有利于樹脂的吸附。因此上樣液的pH值宜控制在6左右。

表4 上樣液pH值對(duì)比吸附量的影響 （n=3）Tab.4 The effect of feed pH value on adsorption amount（n=3）

2.3.4 泄漏曲線的考察

精密吸取250 mL上樣液進(jìn)行上柱。分段收集流出液，每25 mL收集，收集10份。測(cè)定過(guò)柱液中皂苷質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖1。

圖1 泄漏曲線的考察Fig.1 The leak of sample

從圖中可知，當(dāng)過(guò)柱液體積增加到50 mL時(shí)，D101大孔吸附樹脂對(duì)TsPJ的吸附逐漸趨于飽和，TsPJ開始明顯泄漏。故認(rèn)為樣液的最佳上樣體積不超過(guò)50 mL，即上樣比不超過(guò)60.79 mg/g樹脂。

2.3.5 洗脫溶媒的選擇

根據(jù)已確定的最佳動(dòng)態(tài)吸附條件，吸取樣液上柱。預(yù)吸附1h，然后用水洗除糖等雜質(zhì)至Molish反應(yīng)呈陰性，然后分別用蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各5BV上柱洗脫，流量控制為1.0 mL/min，蒸餾水每管收集50 mL，乙醇每管收集30 mL（即1BV），分別測(cè)定TsPJ水平，并繪制洗脫曲線如圖2。

從圖中洗脫曲線所示可知，TsPJ主要集中在50%和70%的乙醇洗脫液中，占全部乙醇洗脫液中總皂苷的80.61%，繼續(xù)加入95%乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液總皂苷量無(wú)明顯變化。此外，綜合考慮生產(chǎn)成本、洗脫效率即真空濃縮工藝等，選擇70%乙醇為洗脫溶媒更為合適。故在洗脫過(guò)程中，先用蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)，再用70%乙醇對(duì)TsPJ進(jìn)行洗脫。

圖2 D101大孔樹脂洗脫曲線Fig.2 The elution curve of D101 macroporous resin

2.3.6 洗脫溶媒用量的考察

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)選定的吸附條件和洗脫溶媒，上樣吸附后進(jìn)行洗脫。蒸餾水用量分別選擇5BV（條件 l）、4BV（條件2）、3BV（條件 3），洗脫溶媒 5BV，依次洗脫，并將體積流量控制在1.0 mL/min。分段收集洗脫液，測(cè)定其總皂苷。前3BV乙醇洗脫液水浴揮干并置于烘箱恒質(zhì)量，計(jì)算總固物質(zhì)量和總皂苷，結(jié)果見表5。

表5 D101大孔樹脂不同條件洗脫參數(shù)考察Tab.5 The elution paraments of D101 macroporous resin on the differente conditions

3 種洗脫條件所得總固物量接近，且總皂苷量均在80%左右，從成本和節(jié)能考慮選擇3BV蒸餾水洗去雜質(zhì)。用70%乙醇洗脫TsPJ時(shí)，前3BV洗脫率將近90%，而后2BV洗脫率不到6%，并且各不同條件下洗脫所得總固物和總皂苷無(wú)明顯差異，故選擇3BV 70%乙醇為洗脫溶媒。

2.3.7 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選大孔吸附樹脂純化工藝參數(shù)

以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為參考，選取影響效果較大的徑高比、洗脫流量、洗脫溶劑用量進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，并采用TsPJ轉(zhuǎn)移率和純度為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，優(yōu)選純化條件。實(shí)驗(yàn)水平表及分析結(jié)果分別見表6、表7和表8。

表6 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Tab.6 Factors and levels orthogonal test

由表7的極差可知，各因素對(duì)TsPJ轉(zhuǎn)移率影響大小順序?yàn)镃（洗脫溶劑用量）＞A（徑高比）＞B（體積流量）。表8的方差分析表明，徑高比、流量均對(duì)TsPJ的純化過(guò)程具有顯著影響，洗脫溶劑用量具有極顯著影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，大孔吸附樹脂純化TsPJ的最佳工藝條件為A3B2C1，即：徑高比為1 ∶10，體積流量為 1.0 mL/min，洗脫溶劑用量為3BV。

2.3.8 工藝重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為考察TsPJ的純化率和精制度，根據(jù)單因素和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按最佳吸附和洗脫條件進(jìn)行驗(yàn)證，平行3份，結(jié)果見表9。由表9可知，純化后TsPJ占總固物的82.53%，精制度達(dá)到338.81%，轉(zhuǎn)移率達(dá)到88.02%。表明用D101大孔吸附樹脂純化TsPJ的工藝較為穩(wěn)定可靠，且純化效果較好。

表7 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 （n=3）Tab.7 L9（34）orthogonal test and results

表8 方差分析Tab.8 Variance analysis

2.3.9 樹脂重復(fù)使用周期的考察

取新的D101大孔吸附樹脂柱3根，根據(jù)已確定的最佳吸附及洗脫條件，在同一根樹脂柱上反復(fù)進(jìn)行吸附和洗脫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表10。

表9 工藝參數(shù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.9 The experiment of technique validation

表10 D101大孔吸附樹脂的重復(fù)使用周期考察 （n=3）Tab.10 The review of reusing cycles D101 macroporousresin（n=3）

結(jié)果表明，新的D101型大孔吸附樹脂的比吸附量與用過(guò)1次、2次、3次后的比吸附量差別不大，但是樹脂重復(fù)使用4次后，吸附性能較之新樹脂有所下降，可能與其上樣時(shí)容易出現(xiàn)結(jié)板和氣泡有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，新樹脂使用后顏色變深，用95%的乙醇浸泡24h以上，用乙醇和蒸餾水反復(fù)洗脫后顏色會(huì)變淺，說(shuō)明其再生利用的效果較好。

3 討論

皂苷是一類相對(duì)分子質(zhì)量較大、極性較大的苷類化合物，藥材中共存的鞣質(zhì)及糖類等成分的影響使得皂苷類成分難以分離提純。大孔樹脂作為一類新型非離子型高分子化合物，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于天然藥物有效部位的分離與純化。D101、HPD100、LX-68及AB-8均為球形非極性或弱極性聚合物多孔吸附劑，對(duì)皂苷類成分有特殊的選擇性，適合從水溶液中提取皂苷類成分；而S-8雖然是苯乙烯型極性共聚體，也作為考察指標(biāo)之一進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)明，相比于其它類型大孔吸附樹脂，D101樹脂對(duì)TsPJ有著相對(duì)較高靜態(tài)吸附量和靜態(tài)解析率。

而到目前為止，我國(guó)仍然沒有一套由權(quán)威機(jī)構(gòu)制訂的使用考察方案，各個(gè)使用單位在樹脂考察方面也是不盡相同。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)大孔樹脂的吸附、洗脫兩個(gè)特點(diǎn)，以提取液上樣濃度、上樣液pH值、上樣量、上樣體積流量、洗脫體積流量、洗脫溶劑選擇及用量等為主要考察項(xiàng)目，逐一進(jìn)行單因素考察，然后再參照單因素考察結(jié)果，將未列入單因素考察項(xiàng)目的樹脂柱徑高比和單因素實(shí)驗(yàn)中影響較大的體積流量、洗脫溶劑用量進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，最后將考察結(jié)果列入樹脂純化工藝參數(shù)，比較全面地制訂了一套比較實(shí)用的樹脂工藝考察方案。并確立了D101型大孔樹脂分離TsPJ的純化工藝：上樣濃度0.2 g生藥/mL，pH值6，徑高比為1∶10，以3BV 70%乙醇溶液洗脫，吸附及洗脫體積流量均為1 mL/min。研究結(jié)果表明，未純化前總固物中總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.36%，純化后總固物中的TsPJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82.53%，精制度達(dá)338.81%，且轉(zhuǎn)移率達(dá) 88.02%。從精制度、轉(zhuǎn)移率等方面考慮，該工藝適宜于TsPJ的分離及純化。

層析柱的粗細(xì)會(huì)影響分離效果，當(dāng)柱子太細(xì)，洗脫時(shí)，樹脂易結(jié)塊，壁上易產(chǎn)生氣泡，體積流量會(huì)逐漸降為零，因此不能選擇過(guò)細(xì)的柱子，避免造成較大誤差。而較小的樹脂粒徑和較低的樹脂高度有利于增大吸附速度，但同時(shí)也使單柱的吸附量有所降低，所以樹脂柱最佳徑高比一般選擇在1∶7～1∶10范圍內(nèi)。

吸附過(guò)程為一放熱過(guò)程，故還應(yīng)考慮上樣液的溫度，有文獻(xiàn)報(bào)道，低溫有利于提高中藥成分的比上柱量［10］，建議在上樣前將樣品液冷藏處理。提取液在上柱前，必須進(jìn)行抽濾或離心等預(yù)處理以除去沉淀和雜質(zhì)，上樣液越澄清，所得產(chǎn)物的純度越高，亦能提高樹脂的使用壽命，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)考察可知用活性碳進(jìn)行脫色處理后的樣品液通過(guò)樹脂柱后所得產(chǎn)物純度較未進(jìn)行脫色處理時(shí)高，而且樹脂再生更為容易。

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Separation and purification of total saponin from Panacis japonici Rhizoma by macroporous resins

OUYANG Li-na， WU Xue， LI Lan-lin， SUN Xiao-bo， XIANG Da-xiong*
（1.The Second Xiangya Hospital of Central Sounth University，Changsha 410011，China；2.The First People Hospital of Yueyang City，Yueyang 414000，China；3.Beijing Jishuitan Hospital，Beijing 100035，China）

Panacis Japonici Rhizoma；total saponin；macroporous resins；purification

R284.2

A

1001-1528（2011）07-1163-06

2010-09-17

湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（2009062）

歐陽(yáng)麗娜（1984—），女，主要從事藥物新資源及新課型的開發(fā)。Tel：（0731）5292093，E-mail：ouyanglina410@126.com

* 通信作者：向大雄，Tel：（0731）5292093，E-mail：xiangdaxiong@163.com