迷迭香酸對大鼠心肌缺血損傷保護作用機制的探討

劉錫強， 李 麗， 田京偉

(1.淄博市中心醫(yī)院干?？?，山東淄博255036;2.煙臺大學藥學院，山東 煙臺264000)

迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是1958年由Elis首次從唇形科植物迷迭香中分離得到，是水溶性多酚類化合物，在植物中的分布較為廣泛，主要存在于唇形科、紫草科、葫蘆科、椴樹科、傘形科的多種植物中［1-2］。國內外的研究證明，迷迭香酸是一種具有多功能的天然活性物質，具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫調節(jié)等廣泛的藥理學作用［3］。本實驗通過建立大鼠冠脈結扎心肌缺血模型，觀察迷迭香酸對心肌缺血保護作用的相關指標，從而探討其可能機制，為中藥開發(fā)治療心血管疾病提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠120只，體質量(250±30)g，由山東綠葉制藥天然藥物研發(fā)中心提供。

1.2 藥物與試劑 迷迭香酸實驗樣品由山東綠葉天然藥物研發(fā)中心藥理實驗室提供，純度為99.7%，硝酸異山梨酯(齊魯制藥有限公司，規(guī)格:10 mL:10 mg，批號:08110382);SOD試劑盒、MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產，兔抗鼠多克隆抗體(bcl-2、bax):武漢博士德生物工程有限公司;UltraSensitiveTMS-P免疫組化染色試劑盒:福州邁新生物技術開發(fā)有限公司;HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備 取60只雄性Wister大鼠為A組，另取60只為B組，A、B各組隨機分為假手術組(生理鹽水10 mg/kg)、缺血模型組(生理鹽水10 mg/kg)、硝酸異山梨酯組(20 mg/kg)，迷迭香酸小劑量組(50 mg/kg)，迷迭香酸中劑量組(100 mg/kg)，迷迭香酸高劑量組(200 mg/kg)。各組給藥體積均按20 mL/kg口服給予相應濃度藥液，1次/d，連續(xù)灌胃5 d。大鼠連續(xù)灌胃給藥5 d后，以100 mg/L水合氯醛(3 mL/kg)腹腔麻醉后，仰位固定。自胸骨左側3～4肋間縱行切開皮膚2 cm，分離筋膜及肌層，于心尖搏動明顯處撥開肋間隙輕壓右側胸廓擠出心臟，在左心耳根部下方，即肺動脈圓錐及左房間找出冠狀動脈左前降支，除假手術組只穿線不結扎外，其它各組在距起點2～3 mm處穿一“0”號絲線結扎，迅速將心臟復位，立即縫合胸壁使自主呼吸恢復，整個手術在30 s內完成。各組大鼠造模后2 h進行以下實驗。

2.2 細胞內超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)量的測定 將A組大鼠心肌細胞沉淀加入冷的勻漿緩沖液，倒入玻璃勻漿管，插在冰水混合物中充分轉動研磨。然后將心肌細胞勻漿液離心3000 r/min，4℃，15 min。取勻漿上清液，按試劑盒說明檢測細胞內脂質過氧化物SOD活性和MDA量。

2.3 免疫組織化學方法觀察心肌細胞bcl-2，bax蛋白表達取B組大鼠心尖部心肌，至10%福爾馬林溶液中固定24 h，經(jīng)80%的乙醇溶液遞增充分脫水后，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚的石蠟切片，供光鏡觀察及細胞凋亡檢測。按試劑盒說明書進行。胞漿內著棕黃色或褐色顆粒者為蛋白表達陽性細胞。在光學顯微鏡下觀察心肌缺血周圍區(qū)的bcl-2、bax的陽性細胞，采用病理圖像分析系統(tǒng)對切片進行圖像分析，測定每組切片bcl-2、bax免疫組化染色的平均光密度值和陽性細胞數(shù)。按照如下公式計算心肌細胞免疫組化陽性表達指數(shù)(PEI):PEI=平均光密度×陽性細胞百分率。

3 結果

3.1 迷迭香酸對心肌缺血大鼠心肌細胞SOD和MDA的影響 與假手術組比較，缺血模型組大鼠血清SOD活性降低(P＜0.05)、MDA 量升高(P＜0.05)。與缺血模型組比較，迷迭香酸大中小劑量組大鼠血清SOD活性增高、MDA量降低，并隨著迷迭香酸劑量的增加，血清SOD呈升高趨勢、MDA量呈降低趨勢。ID組大鼠血清SOD活性也升高(P＜0.05)、MDA量亦見降低(P＜0.05)。結果表明迷迭香酸能劑量依賴性降低結扎冠狀動脈誘發(fā)的心肌缺血大鼠細胞MDA量，增加SOD活性(見表1)。

表1 迷迭香酸對心肌缺血大鼠心肌細胞SOD、MDA及bcl-2，bax蛋白的影響(±s，n=10)

表1 迷迭香酸對心肌缺血大鼠心肌細胞SOD、MDA及bcl-2，bax蛋白的影響(±s，n=10)

注:與缺血模型組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與假手術組比較△P ＜0.05 △△P ＜0.01。

組別 劑量/(mg/kg) SOD(u/mg) MDA/(nmol/mg蛋白) bcl-2/% bax/%假手術組 - 4.51 ±1.49 7.76 ±1.41 15.0 ±3.8＊＊ 3.90 ±0.8＊＊心肌缺血組 - 1.93±0.68△ 12.88±1.79△ 20.4±3.9 30.5±6.1△△迷迭香酸小劑量組 50 2.56 ±0.57 11.36 ±1.94 23.1 ±3.9 22.3 ±3.8*迷迭香酸中劑量組 100 2.74±0.79* 11.05±1.34* 26.1±4.5△ 15.1±2.3＊△迷迭香酸大劑量組 200 3.12±0.91* 10.59±1.82* 28.3±4.2△ 10.1±2.4＊＊△ID 組 20 3.62 ±1.08＊＊ 10.11 ±2.84＊＊ 24.5 ±3.6 18.9 ±3.7＊△

3.2 缺血心肌細胞bcl-2，bax蛋白表達的檢測 免疫組化染色結果顯示所有組別心肌細胞均有bcl-2，bax蛋白表達，假手術組bcl-2，bax蛋白表達量較少，染色呈淺棕色。與假手術組比，缺血模型組bax蛋白表達明顯升高(P＜0.01)。迷迭香酸各給藥組bcl-2，bax蛋白的表達量比假手術組有所增加，但bax明顯較缺血模型組低(P＜0.05或 P＜0.01)。與假手術組比較ID組bax蛋白表達升高(P＜0.05)，與缺血模型組比較ID組bcl-2蛋白表達無明顯差異性，bax蛋白表達減少(P ＜0.05)(見表1)。

4 討論

在心肌缺血時，兒茶酚胺在缺血區(qū)大量積蓄，經(jīng)代謝可產生大量的氧自由基，在發(fā)生自氧化反應過程中產生大量的超氧陰離子和過氧化氫增加自由基水平。這些活性氧自由基可直接作用于心肌細胞膜而發(fā)生脂質過氧化反應，促進MDA生成增多及SOD活力降低。MDA是由自由基產生的脂質過氧化代謝產物，已普遍用作檢測機體組織中自由基水平的指標;SOD是體內最重要的抗氧化酶，可反映機體抗氧化系統(tǒng)的功能。所以同時檢測MDA量和SOD活性可了解自由基產生和抗氧化系統(tǒng)的功能狀態(tài)［4］。迷迭香酸可使心肌細胞中MDA量降低、SOD活力顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)，說明其對心肌缺血性損傷的保護作用可能與提高抗氧化酶活性，降低自由基水平，抑制脂質過氧化反應有關。

心肌缺血時，心肌組織不僅缺氧和代謝障礙，同時毒性產物蓄積，引起缺血性損傷，若繼續(xù)發(fā)展導致心肌細胞死亡。近年來，普遍認為細胞死亡有兩種機制，即壞死和凋亡。細胞凋亡是一種主動性的基因控制的細胞死亡形式，在正常的生長發(fā)育及許多疾病的發(fā)生中起著非常重要的作用。凋亡的啟動與抑制受多種內源性及外源性信號的刺激［5］，而且在其發(fā)生過程中，有許多因子的參與。其中促凋亡基因與抗凋亡基因bcl-2被認為與細胞凋亡關系密切。bax是bcl-2家族的一個成員，它具有獨立于其它基因以外的細胞毒作用，可不依賴激活和抑制相關基因而誘導細胞凋亡。相反，bcl-2的抗凋亡作用一部分是通過抑制bax的細胞毒作用而實現(xiàn)的。本實驗中Tunel染色進一步驗證了心肌缺血損傷可導致凋亡細胞明顯增多，免疫組化結果亦提示與對照組比較，缺血模型組bax陽性細胞表達明顯增加，bcl-2亦有一定程度增加。目前抑制細胞凋亡的措施并不太多，有研究認為β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑及某些中藥對細胞凋亡有抑制作用［6-7］。近年來，隨著傳統(tǒng)醫(yī)學的發(fā)展，中藥在心血管疾病中的作用越來越受到重視。本實驗中迷迭香酸是山東省天然藥物工程技術研究中心通過結構改造獲得的一個單體化合物，經(jīng)過結構改造后增加了其水溶性及穩(wěn)定性。實驗中與缺血模型組比較，迷迭香酸給藥組細胞凋亡數(shù)目明顯減少，免疫組化結果同時表明迷迭香酸能上調抗凋亡因子bcl-2和下調促凋亡因子bax的表達，說明迷迭香酸抗心肌缺血的機制可能與其對凋亡基因的調節(jié)密切相關。

［1］劉鷹翔，計志忠.迷迭香酸藥理作用的研究進展［J］.國外醫(yī)藥植物分冊，1993，8(6):248-251.

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［3］陳立亞.迷迭香酸的研究概況［J］.中國藥事，2007，21(11):923-926.

［4］李 林，黃松明，趙三龍，等.氧化應激對大鼠腎臟系膜細胞增生的影響及迷迭香酸的干預作用［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2007，16(25):3627-3629.

［5］Thomnson CB.Apoptos is in the pathogenesis and treatment of diease［J］.Seienee，1995，267:1456-1462.

［6］常志文，劉 琦.缺血再灌注心肌細胞凋亡及藥物干預［J］.中國新藥雜志，2000(9):28-30.

［7］張 萍，林敬明，孝志粱，等.復方丹參注射渣對兔急性心肌梗塞細胞凋亡的影響［J］.中藥材，2001(24):502-504.