夜交藤改善睡眠活性成分研究

汲廣全， 楊 娟， 楊小生

(貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550002)

隨著社會的發(fā)展、現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快以及生活方式的改變，各種睡眠障礙性疾病日益成為一個突出的問題，失眠則被列為最常見的幾種睡眠疾病之首［1］。對于失眠癥的治療，與西藥相比，中藥以其藥源廣泛、副作用和依賴性小等優(yōu)勢日益受到人們關(guān)注［2］。

夜交藤為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorumThunb.的藤莖或帶葉藤莖，又名首烏藤［3］。夜交藤作為一種常用中藥，性平無毒、味甘微苦，具有養(yǎng)心安神，祛風(fēng)通絡(luò)之功效［4］。目前對夜交藤改善睡眠的報道［5－7］，主要是對其水煎劑及不同種類化學(xué)成分總提物的改善睡眠活性進行研究，而夜交藤中改善睡眠的活性成分還不明確，本實驗對夜交藤改善睡眠活性部位的化學(xué)成分進行了分離純化，并發(fā)現(xiàn)了其具有較好改善睡眠效果的活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

夜交藤(Caulis polygoni multiflori)采自貴州省施秉縣何首烏種植示范基地，為何首烏Polygonum multiflorumThunb的藤莖;♂性昆明小鼠，18～22 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供［生產(chǎn)許可證號:SCXK(黔)2002－0001］。D101型大孔樹脂(滄州寶恩化工有限公司);戊巴比妥鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號:WS20060401);棗仁安神制劑(貴州同濟堂制藥公司，批號:20090702);褪黑素膠囊(惠普生，南寧富萊欣生物科技發(fā)展有限公司，批號:HP00045)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 稱取夜交藤干燥藥材1 kg，粉碎，用75%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液減壓濃縮至無醇味，得到夜交藤醇提物。夜交藤醇提物加適量水混懸，用石油醚進行萃取，得到石油醚萃取部分和水部分。

對石油醚萃取后的水層部分濕法上大孔樹脂柱，用乙醇梯度洗脫，分別得到大孔樹脂蒸餾水洗脫部分，30%，60%和90%乙醇洗脫部分。

1.2.2 實驗分組 將70只小鼠隨機分為7組，每組10只，分別為石油醚萃取組、蒸餾水洗脫組、30%乙醇洗脫組、60%乙醇洗脫組、90%乙醇洗脫組、空白對照組和棗仁安神制劑陽性對照組。

1.2.3 供試品的配制

(1)石油醚浸膏灌胃液的制備:稱取該浸膏溶于由花生油、吐溫和水(1:1:8)配制的溶液中;

(2)空白對照:為生理鹽水;

(3)陽性對照:為市售藥用棗仁安神制劑，水溶液配制;

(4)蒸餾水洗脫部分灌胃液:用蒸餾水配制;

(5)30%，60%和90%部分灌胃液:1%羧甲基纖維素鈉配制。

1.2.4 改善睡眠試驗［8－9］對戊巴比妥鈉閾下催眠劑量的影響:小鼠連續(xù)灌胃3 d，于末次灌胃30 min后，各組小鼠腹腔注射25 mg/kg戊巴比妥鈉閾下催眠劑量，觀察在30 min內(nèi)翻正反應(yīng)消失的小鼠只數(shù)(翻正反射消失1 min以上者)。

延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗:小鼠連續(xù)灌胃3 d，于末次灌胃30 min后，各組小鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉閾上催眠劑量，觀察記錄腹腔注射后小鼠翻正反應(yīng)消失(翻正反射消失1 min為指標(biāo))到恢復(fù)的時間，即睡眠持續(xù)時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 夜交藤改善睡眠活性部位的確定

從表1可以看出，在戊巴比妥鈉閾下催眠劑量實驗中，30%乙醇洗脫組和60%乙醇洗脫組小鼠入睡只數(shù)分別為5只和4只，與空白組比較有顯著差異，而與酸棗仁陽性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義;在戊巴比妥鈉閾上催眠劑量實驗中，30%和60%乙醇洗脫組與空白對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，與酸棗仁陽性對照組相比，差異不顯著，說明這兩部分具有較好的改善小鼠睡眠活性。

表1 夜交藤各組分對小鼠睡眠的影響(n=10，±s)

表1 夜交藤各組分對小鼠睡眠的影響(n=10，±s)

注:與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01;與陽性對照組相比，△P＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 給藥劑量/(g/kg)小鼠入睡只數(shù)小鼠睡眠時間/min可延長睡眠時間/%空白組 0 0△ 41.9±5.3△△ －48.5石油醚萃取組 6.1(生藥) 0△ 45.0±5.6△△ 7.2蒸餾水洗脫組 6.1(生藥) 0△ 40.8±4.3△△ －30%乙醇洗脫組 6.1(生藥) 5* 60.9±8.4** 47.7 60%乙醇洗脫組 6.1(生藥) 4* 64.5±8.1** 53.9 90%乙醇洗脫組 6.1(生藥) 1△ 43.9±6.5△△ 4.7棗仁安神制劑組 0.168(制劑) 5* 62.2±7.9**

2.2 夜交藤活性部位化學(xué)成分的分離純化

2.2.1 提取與分離 另取夜交藤干燥藥材20 kg，按照1.2.1項所述方法得到大孔樹脂60%乙醇洗脫部分(231g)。將該洗脫部分進行硅膠柱層析，氯仿－甲醇梯度洗脫，得到Fr 1～Fr 4四個部分。其中Fr 1和Fr 2部分分別經(jīng)硅膠柱層析，石油醚－丙酮(10∶1)洗脫后，用Sephadex LH－20凝膠柱純化得化合物1和化合物2;Fr 3部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，氯仿－甲醇(20∶1)洗脫得到化合物3和化合物4。

2.2.2 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1:黃色晶體，EI－MSm/z(%):284［M］+(100);1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.61(1H，s，5－H)，7.35(1H，s，4－H)，7.08(1H，s，7－H)，6.69(1H，s，2－H)，3.94(3H，s，Ar－OCH3)，2.45(3H，s，Ar－CH3)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:190.8(C－9)，182.0(C－10)，166.4(C－3)，165.1(C－1)，162.1(C－8)，148.4(C－6)，135.2(C－5a)，133.2(C－4a)，124.5(C－7)，121.2(C－5)，113.7(C－1a)，110.0(C－8a)，108.2(C－4)，106.6(C－2)，56.0(Ar－OCH3)，22.0(Ar－CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］相符，化合物鑒定為大黃素甲醚。

化合物 2:橙黃色針晶，EI－MSm/z(%):270［M］+(100);和大黃素對照品對照，TLC的Rf值和顯色一致，確定為大黃素。

化合物 3:黃色針晶，EI－MSm/z(%):284 ［M－glu］+(100);1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:13.03(1H，s，1－OH)，7.46(1H，s，5－H)，7.33(1H，d，J=2.4 Hz，4－H)，7.16(1H，s，2－H)，7.16(1H，s，7－H)，5.15(1H，d，J=7.2 Hz，糖上端基H，β構(gòu)型)，4.70(1H，t，J=6.0 Hz，糖上 C6－OH)，3.16～3.75(6H，m，糖上的6個 H)，3.95(3H，s，6－OCH3)，2.40(3H，s，3－CH3);13C－NMR(100 MHz，DMSO－d6)δ:186.5(C－9)，181.9(C－10)，164.7(C－6)，161.7(C－8)，160.7(C－1)，147.2(C－3)，136.4(C－5a)，132.1(C－4a)，124.3(C－2)，119.4(C－4)，114.5(C－1a)，114.4(C－8a)，107.3(C－7)，106.5(C－5)，100.6(glu－C－1)，77.5(glu－C－5)，76.6(glu－C－3)，73.3(glu－C－2)，69.8(glu－C－4)，60.8(glu－C－6)，56.1(6－OCH3)，21.5(3－CH3)。與文獻［11］對照確定為大黃素甲醚－8－O－β－D－葡萄糖苷。

化合物 4:黃色針晶，EI－MSm/z(%):270 ［M－glu］+(100);1H－NMR(400 MHz，DMSO－d6)δ:13.08(1H，s，1－OH)，7.41(1H，s，5－H)，7.26(1H，d，J=2.4 Hz，4－H)，7.11(1H，s，2－H)，6.99(1H，d，J=2.4 Hz，7－H)，5.04(1H，d，J=7.6 Hz，糖上端基H，β構(gòu)型)，4.64(1H，t，J=6.0 Hz，糖上 C6－OH)，3.32～3.73(6H，m，糖上的6 個 H)，2.37(3H，s，3－CH3);13C－NMR(100 MHz，DMSO－d6)δ:186.4(C－9)，182.1(C－10)，164.2(C－6)，161.7(C－8)，161.1(C－1)，146.9(C－3)，136.5(C－5a)，132.0(C－4a)，124.2(C－2)，119.3(C－4)，114.4(C－1a)，113.3(C－8a)108.4(C－7)，108.4(C－5)，100.8(glu－C－1)，77.3(glu－C－5)，76.4(glu－C－3)，73.3(glu－C－2)，69.4(glu－C－4)，60.6(glu－C－6)，21.4(3－CH3)。與文獻［11］對照確定為大黃素－8－O－β－D－葡萄糖苷。

2.3 改善睡眠活性成分的確定

由于化合物1和化合物3在藥材中的含量較低，分離得到的量不足以進行整體動物試驗，所以只對化合物2(大黃素)和化合物4(大黃素－8－O－β－D－葡萄糖苷)進行了改善睡眠試驗。將50只小鼠隨機分為5組，分別為大黃素組、大黃素糖苷組、空白組、棗仁安神制劑和褪黑素陽性對照組，改善睡眠試驗同1.2.4項。從表2可以看出:大黃素糖苷組在戊巴比妥鈉閾下催眠劑量實驗中小鼠入睡只數(shù)與棗仁安神制劑組和褪黑素組相接近，而與空白組相差較大;在戊巴比妥鈉閾上催眠劑量實驗中，大黃素糖苷組小鼠睡眠時間與空白組差異極顯著(P＜0.01)，而與兩個陽性對照組差異不顯著，說明大黃素－8－O－β－D－葡萄糖苷具有較好的改善小鼠睡眠活性。

表2 夜交藤活性部位化學(xué)成分對小鼠睡眠的影響(n=10，±s)

表2 夜交藤活性部位化學(xué)成分對小鼠睡眠的影響(n=10，±s)

注:與空白組相比，*P＜0.05，**P＜0.01;與陽性對照組相比，△P＜0.05，△△P ＜0.01。

組別 給藥劑量/(mg/kg)小鼠入睡只數(shù)小鼠睡眠時間/min可延長睡眠時間/%空白組 0 1△ 36.9±7.4△△ －大黃素組 45 1△ 41.6±12.0△△ 12.7大黃素糖苷組 45 5* 59.0±15.3** 59.9棗仁安神制劑組 168 6* 54.3±9.7** 47.2褪黑素 84 7* 61.1±18.9**65.6

3 討論

夜交藤中主要含有蒽醌類成分、二苯乙烯苷類成分，含量較高的代表性化合物分別為大黃素、2，3，5，4′－四羥基二苯乙烯－2－O－β－D－葡萄糖苷［4］。關(guān)于蒽醌類成分改善睡眠功能的報道，有學(xué)者提到大黃能延長巴比妥類藥物助睡眠時間，大黃素42 mg/kg可延長睡眠時間18.7%，蘆薈大黃素40 mg/kg可延長睡眠時間64.3%，大黃酸作用最強，47 mg/kg可延長睡眠時間 87.8%［12］。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素－8－O－β－D－葡萄糖苷也有改善睡眠的作用，而大黃素改善睡眠的作用與空白組比較差異不顯著。至于大黃素苷比大黃素苷元改善睡眠效果好的原因有待進一步研究。此外，從夜交藤各分段提取物改善睡眠實驗結(jié)果可以看出，除了大孔樹脂60%乙醇洗脫部分具有較好的改善睡眠活性外，大孔樹脂30%乙醇洗脫部分也同樣具有較好的改善睡眠活性。但是由于該洗脫部位化學(xué)成分極性較大，給分離純化工作帶來極大困難，因此要全面系統(tǒng)的了解夜交藤中改善睡眠的活性成分有待于進一步的研究。

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