RP-HPLC法測定干姜、炮姜和生姜中3種姜酚的含量

孟喜成（山西大同大學(xué)附屬醫(yī)院，大同市 037005）

干姜、炮姜和生姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的根莖及其加工品，3種藥用姜的功效不同，在中醫(yī)臨床的使用也存在一定的差異?，F(xiàn)代藥理研究表明，姜具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤、抗病原體、保肝利膽、抗?jié)?、改善心血管系統(tǒng)等多種藥理作用[1～3]。姜的主要成分為揮發(fā)油和無揮發(fā)性的姜辣素類化合物，2類化合物在組方入藥的過程中均能產(chǎn)生藥理作用。以6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚為代表的姜辣素類化合物是姜的特征性化學(xué)成分之一，研究證實(shí)姜酚具有強(qiáng)心、調(diào)節(jié)血管舒縮功能、抗血小板、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗氧化與保護(hù)心肌等藥理作用[4]。

目前，姜酚類成分的含量測定方法以高效液相色譜（HPLC）法為主，但以往的方法大多采用含酸的流動相體系，易使姜酚脫水形成姜烯酚，降低測定結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。另外，部分方法的前處理過程需要柱層析分離等步驟，較為煩瑣[6～8]。本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，可以在20 min內(nèi)快速測定干姜、炮姜和生姜中6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量，方法簡便、準(zhǔn)確、高效，能夠?yàn)樗幱媒募庸づ谥坪唾|(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型HPLC儀（美國安捷倫公司）；AW 120型電子天平（日本島津公司）；ZN-100微型高速粉碎機(jī)（中南制藥機(jī)械廠）；BRANSON 5510E超聲儀（美國必能信公司）。

干姜（北京同仁堂飲片廠，批號：100520）、炮姜（北京同仁堂飲片廠，批號：100429）、生姜（購自農(nóng)貿(mào)市場），經(jīng)山西省藥品檢驗(yàn)所鑒定均為姜科植物姜Z.officinale Rosc.的根莖及加工品；6-姜酚（批號：E-0128）、8-姜酚（批號：E-0165）、10-姜酚（批號：E-0135）標(biāo)準(zhǔn)品（上海同田生物技術(shù)有限公司，經(jīng)HPLC面積歸一化法檢查純度均＞98.5%）；乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：依利特 Hypersil ODS 2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（72∶28）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚與樣品中其他組分的色譜峰分離完全。色譜見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的制備

精密稱取6-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品11.56 mg、8-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品10.72 mg和10-姜酚標(biāo)準(zhǔn)品10.31 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（6-姜酚為1.156 mg·mL-1、8-姜酚為1.072 mg·mL-1、10-姜酚為1.031 mg·mL-1），置4 ℃冰箱貯藏，備用。

2.3 供試品溶液的制備

干姜和炮姜粉碎后過4號篩，分別精密稱取約0.15 g；生姜適量切成碎末，用濾紙擦干表面汁液，精密稱取約0.15 g，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇45 mL超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理20 min，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.干姜；B.炮姜；C.生姜；D.混合標(biāo)準(zhǔn)品；1.6-姜酚；2.8-姜酚；3.10-姜酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.dried ginger；B.baked ginger；C.fresh ginger；D.mixed standard；1.6-gingerol；2.8-gingerol；3.10-gingerol

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.1、0.5、1、10、20 mL，置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，搖勻，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μL（每份重復(fù)進(jìn)樣3次），測定峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的回歸方程分別為Y＝1.1377X+0.1265（r＝0.9999，n＝5）、Y＝1.1126X+0.1343（r＝0.9998，n＝5）、Y＝1.0968X+0.1564（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的進(jìn)樣濃度分別在1.156～231.200、1.072～214.400、1.031～206.200 μg·mL-1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別取3種姜酚低、中、高3種濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣3次，考察方法的日內(nèi)精密度。結(jié)果，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積的RSD分別為0.25%、0.42%、0.52%（n＝9）；再連續(xù)3 d進(jìn)樣，考察方法的日間精密度。結(jié)果，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積的RSD分別為0.36%、0.63%、0.73%（n＝9），表明方法的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取干姜粉末適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、1、3、6、12、24 h測定6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的峰面積。結(jié)果，3種姜酚峰面積的RSD分別為0.89%、1.13%、1.05%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取干姜粉末適量，共6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定3種姜酚的含量。結(jié)果，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量的RSD分別為0.55%、0.82%、0.49%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知3種姜酚含量的干姜樣品粉末適量，共6份，精密加入適量3種姜酚標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

精密稱取干姜、炮姜和生姜樣品粉末適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法測定3種姜酚的含量，結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 干姜、炮姜和生姜中3種姜酚的含量測定結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of the content determination of 3 gingerols in dried ginger，baked ginger and fresh ginger（n＝5）

3 討論

本試驗(yàn)對超聲和回流等提取方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)超聲提取的3種姜酚成分含量要高于回流提取，分析其原因?yàn)榧訜峄亓魈崛菇宇惓煞职l(fā)生脫水轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致含量降低。另外，分別采用50%、75%和純甲醇作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)純甲醇對此類成分具有更高的提取效率。通過對超聲提取時間的考察，發(fā)現(xiàn)到20 min后3種姜酚的含量不再增加，可保證提取完全。故最終選擇樣品提取方法為加甲醇45 mL超聲處理20 min。

選擇230 nm和280 nm特征波長進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)230 nm處于吸收曲線的肩峰位置，易受到干擾；選擇280 nm作為檢測波長，色譜圖峰形較好、靈敏度高。同時，本試驗(yàn)比較了甲醇-水和乙腈-水流動相體系，從保留時間和分離度進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水體系的分離效果更好，3種姜酚的色譜峰與相鄰色譜峰均可以達(dá)到基線分離。另外，在乙腈-水體系中添加不同濃度的冰醋酸，對色譜峰峰形與保留時間沒有明顯影響，故最終選擇乙腈-水體系作為本試驗(yàn)的流動相，能夠在20 min內(nèi)完成3種成分的含量測定。

本方法可以為藥用姜及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和評價提供依據(jù)，為藥典的含量測定方法提供有益的補(bǔ)充。

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