雷公藤多苷對(duì)大鼠卵泡發(fā)育及其旁分泌調(diào)控機(jī)制的影響Δ

楊涓，高慧，韓冰，董江川（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶市 400016；.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，承德市 067000；.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津市 00150；4.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶市 4011）

雷公藤多苷（GTW）是臨床應(yīng)用最廣泛的雷公藤制劑，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等藥理作用。部分自身免疫性疾病女性患者服藥后發(fā)生月經(jīng)紊亂和閉經(jīng)，故成為卵巢早衰的醫(yī)源性因素之一[1]。既往研究表明，GTW對(duì)生殖功能具有抑制作用，表現(xiàn)為月經(jīng)周期延長(zhǎng)、閉經(jīng)、血漿雌二醇（E2）水平下降，卵泡雌激素（FSH）升高，故認(rèn)為其作用靶點(diǎn)在卵巢[2]，而對(duì)其生殖毒理的研究則以細(xì)胞凋亡為主要研究方向[3]，未見雷公藤對(duì)卵泡發(fā)育調(diào)控因子影響的研究報(bào)道。本課題組通過對(duì)大鼠卵巢結(jié)構(gòu)觀察及各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)比較研究GTW對(duì)各發(fā)育階段卵泡的影響，并通過對(duì)旁分泌調(diào)控因子卵泡刺激素特異受體（FSHR）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和縫隙連接蛋白 43（Cx43）mRNA的表達(dá)觀察GTW對(duì)卵泡發(fā)育調(diào)控機(jī)制的影響，探討其生殖毒理機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

PMr10AD型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；JEM-1010型透射電鏡儀（日本電子公司）；SYD-K2030型冷凍病理切片機(jī)（沈陽譽(yù)德電子儀器有限公司）；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（瑞士羅氏公司）；722型紫外分光光度計(jì)（上海天普分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

GTW片（湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號(hào):20050402）；Trizol RNA提取試劑（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào):15596026）；LightCycle SYBR Green I RNA一步法擴(kuò)增試劑盒和LightCycle質(zhì)控盒（德國(guó)Roche公司）；基因引物由寶生物（大連）有限公司合成。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，12周齡，♀，體重（260±10）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（京）2002-0001）。每日行陰道脫落細(xì)胞涂片，凡間隔4～5 d出現(xiàn)2次動(dòng)情期者納入實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組和給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常（等容蒸餾水）和GTWⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ（5、10、20、50、75 mg·kg-1）組。除正常組外，其余各組ig相應(yīng)GTW片水溶液，每天1次，連續(xù)28 d，第29天處死大鼠。

2.2 組織學(xué)觀察

切取的卵巢組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)5μm切片后蘇木精-伊紅（HE）染色、封片，取最大剖面切片光鏡下觀察，并計(jì)數(shù)具有正常結(jié)構(gòu)的各級(jí)卵泡數(shù)、卵泡總數(shù)及黃體數(shù)。卵泡分級(jí)方法參考文獻(xiàn)[4，5]:小卵泡直徑＜30μm，中卵泡直徑30～600μm，大卵泡直徑＞600μm；電鏡組織經(jīng)固定、沖洗、脫水、包埋、半薄切片定位后制成超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡儀觀察卵巢超微結(jié)構(gòu)。

2.3 組織總RNA提取

總RNA提取:參照Trizol RNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行抽提。將卵巢組織加入液氮研磨后，加入1.5 mL trizol勻漿，加入氯仿振蕩離心，取上層水相加入異丙醇靜置離心，取沉淀加75%乙醇，振蕩離心，倒掉乙醇吹干，加無RNA酶水振蕩、離心、水浴再離心。完整性檢測(cè):取總RNA稀釋液與Lodding buffer混合加入凝膠孔中電泳，紫外透射電鏡儀上于254 nm波長(zhǎng)處紫外光觀察，完整的真核細(xì)胞核糖體RNA可見28、18、5 S 3條電泳帶。純度、濃度檢測(cè):取3 μL RNA樣品稀釋10倍，于紫外分光光度計(jì)探頭上測(cè)定280/260（核酸/蛋白）、280/230（核酸/有機(jī)相）及濃度（ng·μL-1）數(shù)值。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)

FSHR、EGF和Cx43的基因引物序列見表1。

表1 FSHR、EGF和Cx43的基因引物序列Tab 1 The gene primer sequence of FSHR，EGF and Cx43

2.4.1 反應(yīng)系統(tǒng) （總量20μL）Mix SYBR GreenⅠ（4μL），Resolution Solution（2 μL），MgCl2stock solution（2.4 μL），Enzyme mix（0.4 μL），Primer（上下游）（各1 μL），Total RNA（陰性對(duì)照用水）（800 ng），H2O（PCR-grade）（可變化）。反應(yīng)條件:55℃ 30 min，合成cDNA；95℃ 30 s孵育，56.1℃退火10 s，72℃延伸15 s，循環(huán)40次；60℃建立融解曲線。

2.4.2 目的基因檢測(cè) 用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件檢測(cè)目的基因的循環(huán)閾（Ct）值，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板拷貝數(shù)。定量PCR儀擴(kuò)增完成后自動(dòng)生成熒光強(qiáng)度曲線，該熒光強(qiáng)度曲線反映所有標(biāo)本不同循環(huán)時(shí)的熒光強(qiáng)度，陽性標(biāo)本呈現(xiàn)典型的S型曲線，陰性對(duì)照即使擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)也為不規(guī)則的波浪線。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。所有計(jì)量資料均以表示，兩樣本比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 組織形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下觀察，正常組卵巢內(nèi)可見原始卵泡、生長(zhǎng)卵泡、成熟卵泡等各級(jí)卵泡，卵泡排列緊密，未見明顯的閉鎖卵泡，黃體數(shù)目較多，血管豐富；GTWⅠ組與正常組相當(dāng)；GTWⅡ組卵巢輕度間質(zhì)纖維化改變，血管減少，小卵泡明顯減少；GTWⅢ、Ⅳ、Ⅴ組卵巢間質(zhì)纖維化改變明顯，血管明顯減少，各級(jí)卵泡及黃體明顯減少。HE染色結(jié)果見圖1。

圖1 HE染色結(jié)果（HE×40）A.正常組；B.GTWⅠ組；C.GTWⅡ組；D.GTWⅢ組；E.GTWⅣ組；F.GTWⅤ組Fig 1 Results of HE staining（HE×40）A.normal group；B.GTWⅠ group；C.GTWⅡgroup；D.GTWⅢgroup；E.GTWⅣgroup；F.GTWⅤgroup

電鏡下觀察，正常組卵巢內(nèi)卵泡排列緊密有序，卵泡膜清晰，胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的線粒體及游離核糖體，細(xì)胞核圓形，有明顯的核仁，染色質(zhì)均勻；GTWⅠ組卵泡排列有序，卵泡膜清晰，顆粒細(xì)胞層豐富，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，細(xì)胞核較大，核仁明顯，核染色質(zhì)欠均勻；GTWⅡ、Ⅲ組細(xì)胞排列尚有序，細(xì)胞間隙稍增寬，胞質(zhì)較豐富，細(xì)胞器輕度變性，線粒體空泡變較明顯，核膜間隙增寬，核染色質(zhì)欠均勻；GTWⅣ、Ⅴ組超微結(jié)構(gòu)明顯受損，卵泡細(xì)胞層次紊亂，大小不一，細(xì)胞間見明顯間隙，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少且結(jié)構(gòu)不清，部分細(xì)胞核呈斑塊狀凝集，細(xì)胞核異染色質(zhì)凝集趨邊，核膜不清。電鏡下觀察結(jié)果見圖2。

圖2 電鏡下觀察結(jié)果（TEM×6000）A.正常組；B.GTWⅠ組；C.GTWⅡ組；D.GTWⅢ組；E.GTWⅣ組；F.GTWⅤ組Fig 2 Observation results under electric microscope（TEM×6000）A.normal group；B.GTWⅠ group；C.GTWⅡgroup；D.GTWⅢgroup；E.GTWⅣgroup；F.GTWⅤgroup

3.2 各級(jí)卵泡、黃體計(jì)數(shù)比較

GTW各組小卵泡較正常組均顯著減少，且小泡數(shù)量與用藥劑量呈負(fù)相關(guān)；GTWⅠ、Ⅱ組大卵泡較正常組無明顯減少，而GTWⅢ、Ⅳ、Ⅴ組均顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），且大泡數(shù)量與用藥劑量呈負(fù)相關(guān)；除GTWⅠ組外，其他各組黃體均顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），且黃體數(shù)量與用藥劑量呈負(fù)相關(guān)。大鼠各級(jí)卵泡和黃體計(jì)數(shù)的比較見表2。

表2 大鼠各級(jí)卵泡和黃體計(jì)數(shù)的比較Tab 2 The amounts of different levels follicles and corpus luteum in ovary

3.3 卵巢組織FSHR、EGF及Cx43 mRNA表達(dá)水平比較

GTW各組FSHR mRNA表達(dá)較正常組均無顯著性差異；GTWⅠ、Ⅱ組EGF mRNA表達(dá)較正常組無顯著性差異，其他各組均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），且表達(dá)強(qiáng)度與用藥劑量呈負(fù)相關(guān)；除GTWⅠ組外，其余各組Cx43 mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），且表達(dá)強(qiáng)度與用藥劑量呈負(fù)相關(guān)。卵巢組織FSHR、EGF及Cx43 mRNA表達(dá)的比較見表3。

4 討論

表3 卵巢組織FSHR、EGF及Cx43 mRNA表達(dá)的比較Tab 3 The mRNA expression level of FSHR，EGF and Cx43 in ovary

既往研究表明，GTW導(dǎo)致生殖抑制的靶點(diǎn)在卵巢[1]。卵泡是卵巢功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，卵泡數(shù)量及結(jié)構(gòu)的改變對(duì)卵巢功能影響較大。原始卵泡數(shù)提示卵巢儲(chǔ)備能力，竇狀卵泡數(shù)則是對(duì)卵巢低反應(yīng)性者的單一預(yù)測(cè)指標(biāo)[6]。卵泡發(fā)育受卵巢血流影響，始基卵泡沒有單獨(dú)的血供，由基質(zhì)血管傳遞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素，故卵巢血流與卵巢反應(yīng)密切相關(guān)[4]。因此，本研究采用卵巢組織病理學(xué)觀察結(jié)合卵泡計(jì)數(shù)比較的方法評(píng)價(jià)GTW對(duì)卵泡發(fā)育的影響。結(jié)果表明，GTW導(dǎo)致卵巢血管減少，組織發(fā)生纖維化改變，卵泡顆粒細(xì)胞層減少，透明帶模糊不清，提示GTW可導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育環(huán)境受到損害；進(jìn)一步觀察顯示卵泡細(xì)胞器減少且變性，組織呈明顯的凝集性損害，提示卵母細(xì)胞本身亦受到了GTW的影響。對(duì)各級(jí)卵泡的計(jì)數(shù)比較顯示，各劑量組小卵泡均明顯減少，提示即使低劑量GTW亦可能對(duì)卵巢儲(chǔ)備造成影響，而隨用藥劑量增大，則中、大卵泡數(shù)和黃體數(shù)明顯減少，提示卵泡的發(fā)育與GTW用藥劑量呈負(fù)相關(guān)。

FSH是刺激卵泡發(fā)育最重要的激素[7]，可促使竇前卵泡及竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞（GC）增殖與分化，縫隙連接形成、分泌卵泡液，使卵泡生長(zhǎng)發(fā)育[8]。但FSH的生理功能需通過分布于性腺的特異性受體FSHR介導(dǎo)，因此FSHR的表達(dá)量直接影響卵巢對(duì)FSH反應(yīng)性。卵母細(xì)胞不存在FSHR，F(xiàn)SH對(duì)其發(fā)育的調(diào)節(jié)必須通過旁分泌途徑實(shí)現(xiàn)，EGF和Cx43是重要的中間環(huán)節(jié)，三者共同調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育。EGF可對(duì)FSH的促卵母細(xì)胞成熟作用有促進(jìn)效應(yīng)，而FSH能顯著增加顆粒細(xì)胞中EGF的結(jié)合點(diǎn)，因此認(rèn)為FSH對(duì)卵泡生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)是通過EGF及其受體來實(shí)現(xiàn)的[9]。卵泡處于無血管的微環(huán)境中，縫隙連接介導(dǎo)卵母細(xì)胞和其周圍體細(xì)胞（顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞）間的代謝交換，傳遞內(nèi)分泌和旁分泌的生長(zhǎng)因子，GC通過縫隙連接持續(xù)低水平發(fā)送cAMP信號(hào)至卵母細(xì)胞，使卵母細(xì)胞滯留在減數(shù)分裂階段，并通過LH誘導(dǎo)信號(hào)途徑（也是一種縫隙連接）使卵母細(xì)胞最終成熟。因此，縫隙連接對(duì)于卵泡的發(fā)育以及甾類激素的分泌具有十分重要的意義。Cx43蛋白是卵巢組織表達(dá)最多的連接蛋白[10，11]。本研究表明，各GTW組FSHR mRNA表達(dá)較正常組均無顯著性差異，而EGF及Cx43 mRNA表達(dá)較正常組顯著下降，其表達(dá)量與藥物劑量呈負(fù)相關(guān)，提示GTW并非通過降低卵巢對(duì)FSH反應(yīng)性來影響卵泡發(fā)育，而是通過降低EGFmRNA表達(dá)影響FSH的旁分泌途徑，并通過降低CX43mRNA表達(dá)影響卵母細(xì)胞和其周圍體細(xì)胞間的代謝交換和內(nèi)分泌、旁分泌生長(zhǎng)因子的傳遞，從而影響卵泡的發(fā)育。

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