藤茶對非酒精性脂肪性肝病的治療作用研究

王俊杰，舒 洋，曹 欣，蔣顯勇，吳海燕，陳福春，方會龍，陳東林

藤茶 (ampelopsis grossedentata)是葡萄科植物蛇葡萄屬中的一種野生藤本植物的嫩莖葉，多生長在海拔200～800 m高的山地上，主要分布于廣西、廣東、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等地。長久以來，我國壯族和瑤族人將其嫩莖葉制成保健茶，用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、黃疸型肝炎、瘡癤等癥。其化學(xué)成分主要為黃酮類、低聚芪類、酚類［1］，其中黃酮類中的二氫楊梅素含量豐富，在幼葉莖中含量占干重的20%以上，在幼葉中可達(dá)40%［2］。我們報道了藤茶及其主要成分二氫楊梅素具有護(hù)肝和抗肝纖維化的作用［3－7］，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究藤茶提取物對小鼠非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的保護(hù)作用，為其保健功效的評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級昆明小鼠48只〔合格證號:Scxk(湘)2009－0012〕，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購自長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部。實驗前適應(yīng)環(huán)境3 d，自由飲水。

1.2 儀器和試劑 儀器:Au640型全自動生化分析儀 (日本Olympous公司)，TSJ－O脫水機(jī) (常州市中威電子儀器廠)，BMJ－Ⅲ型包埋機(jī) (常州市中威電子儀器廠)，Olympus顯微鏡 (日本Olympous公司)。試劑:膽固醇、丙硫氧嘧啶、膽酸鈉，均購于上海藍(lán)季生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藤茶提取物的制備 采摘郴州王仙嶺后山藤茶，晾干，粉碎，95℃熱水提取10 min(料液比1∶20)，過濾。濾渣微波加熱3 min后合并濾液，加熱提取，過濾，濾液室溫下冷卻，析出晶體，干燥得藤茶提取物。吸光度法測定純度:標(biāo)準(zhǔn)品計算藥物濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測藥品溶液加入5%AlCl3溶液3 ml，用95%乙醇定容至10 ml，搖勻后室溫靜置40 min，在404 nm波長下測定吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線計算藥物濃度。

1.3.2 造模方法 小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水。高脂飼料配方:添加2%膽固醇、10%豬油、0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉到基礎(chǔ)飼料中，混合均勻，壓制成條。

1.3.3 分組 48只小鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組及藤茶治療組。正常對照組:正常方法飼養(yǎng)60 d，普通條形飼料喂養(yǎng);模型組:高脂飲食60 d制備NAFLD模型;陽性對照組:在模型組高脂飲食的基礎(chǔ)上灌胃易善復(fù) (多烯磷脂酰膽堿膠囊)150 mg/kg，從實驗第14天開始，1次/d，共治療42 d;藤茶治療組:在模型組高脂飲食基礎(chǔ)上灌胃藤茶提取物300 mg/kg，從實驗第14天開始，1次/d，共治療42 d。

1.3.4 實驗方法 (1)實驗第60天處死4組小鼠。動物處死前禁食12 h，稱體質(zhì)量，眼眶內(nèi)眥取血后分離血清，用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)、總膽固醇 (TC)、三酰甘油 (TG)。(2)迅速剪開腹腔，觀察肝臟形態(tài)。取出完整肝臟，濾紙吸干表面水分后稱重，計算肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量 (mg)/體質(zhì)量(g)×100%。(3)完整分離肝臟左葉，用4%多聚甲醛固定，脫水，包埋，切片，HE染色，封固，光鏡下觀察肝組織病理變化并進(jìn)行分級和評分，方法為:在顯微鏡下肝細(xì)胞內(nèi)含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)比值為0、＜1/3、1/3～2/3、＞2/3～1，分別判定為 － (0分)、+(1分)、++(2分)、+++(3分)、++++(4分)［8］。(4)完整分離肝臟中葉，剪取100 mg，測定肝臟TC、TG。肝臟TC、TG測定方法為:取肝組織加9倍體積的異丙醇，在冰水中制成10%的勻漿，4℃提取24 h，3 000 r/min離心10 min，提取上清液，用全自動生化分析儀測定TG、TC含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。計量資料以表示，多組間均數(shù)的比較采用方差分析;等級資料的比較采用秩和檢驗。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藤茶提取物測定 吸光度法測定純度標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:A=6.21x+0.0105(A為吸光度，x為藥物濃度)，R=0.997639。實驗用藤茶提取物二氫楊梅素含量為45.01%。

2.2 肝臟形態(tài)學(xué)觀察及肝指數(shù)變化 正常對照組小鼠肝臟顏色紅潤，表面光滑，邊緣銳利，包膜完整，質(zhì)地柔軟。模型組小鼠肝臟顏色呈暗褐色，肝臟腫大，質(zhì)脆，包膜緊張，散在分布白色脂滴，表面均勻分布顆粒狀突起。經(jīng)易善復(fù)或藤茶治療后，小鼠肝臟為褐色，肝臟大小及質(zhì)地較模型組明顯改善，散在少量分布白色脂滴，表面均勻分布顆粒狀突起。

正常對照組、模型組、陽性對照組、藤茶治療組小鼠肝指數(shù)分別為 (41.3±4.1)mg/g、(53.5±3.4)mg/g、(48.5±3.6)mg/g和 (48.7±3.1)mg/g，4組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=21.36，p＜0.05)。模型組與正常對照組比較，陽性對照組與模型組比較，藤茶治療組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.01);但陽性對照組與藤茶治療組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，這兩組與正常對照組比較，差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.01)。

2.3 肝組織病理變化 光鏡下，正常對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝竇清晰可見，肝索排列整齊，肝細(xì)胞無脂肪變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央。模型組小鼠肝臟呈中或重度脂肪變性，以中央靜脈周圍明顯，肝細(xì)胞腫脹呈圓形，細(xì)胞核被擠向一邊，胞質(zhì)內(nèi)充滿大量脂肪空泡，脂滴大小不等，甚至融合成大脂滴，界限不清楚。陽性對照組及藤茶治療組小鼠較模型組脂肪變性細(xì)胞明顯減少，脂滴減少或消失，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常 (見圖1)。

圖1 小鼠肝組織切片的形態(tài)改變 (HE染色，×100)Figure 1 Histopa－thological changes of mice liver

根據(jù)肝脂肪變性程度級別標(biāo)準(zhǔn)，計算肝脂肪變性評分，4組小鼠肝脂肪變性評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=16.40，P=0.00);模型組小鼠肝脂肪變性評分顯著高于正常對照組，陽性對照組和藤茶治療組又顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.05)，但陽性對照組與藤茶治療組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)。

2.4 肝功能及血脂變化 模型組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平較正常對照組顯著升高 (p＜0.01)，陽性對照組和藤茶治療組小鼠血清中ALT、AST、TC、TG水平較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.05);但陽性對照組與藤茶治療組小鼠的上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表2)。

2.5 肝臟TC、TG變化 4組小鼠肝臟組織中TC、TG含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.05);模型組小鼠肝臟組織中TC、TG含量較正常對照組顯著升高 (p＜0.01);陽性對照組和藤茶治療組小鼠肝臟組織中TC含量均較模型組顯著降低(p＜0.05)，與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);藤茶治療組肝臟TG含量較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.05);陽性對照組和藤茶治療組TG含量與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.01，見表3)。

表1 4組小鼠肝臟脂肪變性情況比較Table 1 Comparison of degrees of hepatic fatty degeneration among the four groups

表2 4組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較Table 2 Comparison of serum ALT，AST，TC，and TG levels among the four groups

表2 4組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較Table 2 Comparison of serum ALT，AST，TC，and TG levels among the four groups

注:與正常對照組比較，*p＜0.01;與模型組比較，△p＜0.05，★p＜0.01

組別 只數(shù) ALT(U/L)AST(U/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常對照組 11 48± 7 76±14 2.14±0.25 1.06±0.14模型組 11 162±33* 182±25* 4.12±0.33* 1.32±0.15*陽性對照組 9 110±22＊★ 134±21＊★ 3.82±0.22＊△ 1.11±0.11△藤茶治療組 10 120±14＊★ 138±17＊★ 3.75±0.20＊△ 1.08±0.14△F 值0.00 0.00 0.00 0.0003 51.09 52.84 126.03 8.20 P值

表3 4組小鼠肝組織TC、TG含量比較Table 3 Comparison of hepatic levels of TC and TG among the four groups

表3 4組小鼠肝組織TC、TG含量比較Table 3 Comparison of hepatic levels of TC and TG among the four groups

注:與正常對照組比較，*p＜0.01;與模型組比較，△p＜0.05

組別 只數(shù) TC(mmol/L) TG(mmol/L)正常對照組 11 0.38±0.08 0.16±0.04模型組 11 0.52±0.03* 0.28±0.05*陽性對照組 9 0.45±0.04△ 0.25±0.01*藤茶治療組 10 0.40±0.11△ 0.21±0.03＊△F 值＜0.01 ＜0.01 8.46 21.14 P值

3 討論

NAFLD是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，包括單純性脂肪肝以及由其演變的非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化。隨著人們生活水平的提高及生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD在我國的發(fā)病率越來越高，發(fā)病年齡趨向低齡化，已成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。

Day和James提出以氧應(yīng)激/脂質(zhì)過氧化為核心的“二次打擊”學(xué)說［9］，認(rèn)為:各種狀態(tài)所致的脂肪沉積與胰島素抵抗是脂肪性肝炎的第一次打擊;而氧化應(yīng)激/脂質(zhì)過氧化是脂肪肝病程進(jìn)展中的第二次打擊，二次打擊是脂肪變性發(fā)展為脂肪性肝炎、肝纖維化及肝硬化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。及時去除病因及誘因、減輕肝臟脂肪沉積，抑制氧化應(yīng)激可能是防治脂肪性肝炎的有效措施。

我國藤茶資源豐富，來源廣泛，其有效成分二氫楊梅素含量豐富，實驗采用的藤茶提取物二氫楊梅素的含量為45.01%。本研究發(fā)現(xiàn)，藤茶可以明顯改善NAFLD小鼠肝臟脂肪變性，具有潛在的治療NAFLD的作用;還可以降低肝臟TC、TG含量及血清TC、TG、ALT、AST水平，表現(xiàn)出一定的降脂和肝保護(hù)作用。此外，有文獻(xiàn)報道，藤茶還具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化等作用［10］。因此，長期飲用藤茶具有治療NAFLD的功效，其機(jī)制與藤茶抗炎抗氧化、保護(hù)肝臟、減輕肝臟脂質(zhì)沉積有關(guān)。

1 Lu A，Tang Y，Ran R，et al.Brain genomics of intracerebral hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26(2):230－252.

2 李翠蘋，曹樹穩(wěn)，余燕影.二氫楊梅素研究進(jìn)展［J］.化學(xué)試劑，2010，32(7):608－612.

3 方會龍，王俊杰，陳美姿，等.藤茶提取物對血吸蟲病肝纖維化的影響［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2010，13(6):2004－2006.

4 鄺滿元，劉映霞，李映菊，等.藤茶總黃酮抗大鼠肝纖維化的作用 ［J］.南華大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2008，36(6):745－747.

5 方會龍，王俊杰，陳美姿，等.二氫楊梅素治療血吸蟲病肝纖維化的實驗研究［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15(4):381－384.

6 鄺滿元，賈蕾，羅明英.二氫楊梅素對肝纖維化大鼠肝功能及肝纖維化指標(biāo)的影響［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2009，8(2):46－47.

7 鄺滿元，賈蕾，羅明英.二氫楊梅素對肝纖維化大鼠脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)作用［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，6(18):26－28.

8 葛麟，譚正懷，唐大軒，等.輕肝顆粒對小鼠非酒精性脂肪肝的作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2009，25(2):94－97.

9 Day CP.Steatohepatitis:a tale of two"hits" ［J］.Gastroenterology，1998，114:842－845.

10 魏來，趙春景.番茄紅素對非酒精性脂肪肝模型大鼠肝細(xì)胞色素P_ (450)2E1及腫瘤壞死因子－α表達(dá)的影響 ［J］.中國藥房，2010，33(5):3100－3102.