黃芪皂甙和丹參酮ⅡA注射液對大鼠骨骼肌鈍挫傷后氧化應(yīng)激的影響

王茂林 陳世益 李云霞 陳疾忤 李宏云

1 南京醫(yī)科大學附屬明基醫(yī)院骨科（南京 210019） 2 復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院運動醫(yī)學科

骨骼肌損傷是運動醫(yī)學領(lǐng)域常見的創(chuàng)傷，在損傷早期由于肌纖維的破壞，炎性細胞浸潤導(dǎo)致大量氧自由基生成，從而加重骨骼肌損傷［1］。我們先前的研究證實了中藥黃芪丹參復(fù)方注射液具有清除氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷的作用［2］，但復(fù)合物成分較為復(fù)雜，在促進骨骼肌損傷愈合過程中的具體成分仍不清楚。丹參酮ⅡA是丹參的脂溶性有效單體，具有清除氧自由基、改善微循環(huán)、保護血管內(nèi)皮細胞的作用［3］。黃芪皂甙是黃芪中一類重要的有效成分，具有抗自由基損傷及抗脂質(zhì)過氧化作用，對缺血再灌注的心肌和腎臟細胞均有保護作用［4］。本研究通過觀察黃芪皂甙和丹參酮ⅡA注射液對骨骼肌鈍挫傷后早期氧化應(yīng)激的影響，探討黃芪皂甙和丹參酮ⅡA是否是黃芪丹參注射液影響骨骼肌鈍挫傷后氧化應(yīng)激的主要有效成分，從而為其進一步的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組

雄性SD大鼠120只，體重200～220g，購自中國科學院上海實驗動物中心，許可證號：SCXK（滬）2007-0005。國家標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，自由攝食飲水，動物房溫度21～23℃，相對濕度40%～60%。隨機分為：黃芪皂甙組、丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組、生理鹽水對照組，每組24只；依據(jù)不同的觀察時間點，每大組再分為4小組（損傷后第1、4、7、14天組，每小組6只大鼠）。

1.2 骨骼肌鈍挫傷模型的制作

動物用2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（0.2 ml/100g體重）后，參照Kami等［5］的方法，將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位，用重約335 g的重物自80 cm高處垂直打擊大鼠右側(cè)腓腸肌中段（打擊面積為1 cm2，動能為2.63 J），制作骨骼肌急性鈍挫傷模型。解剖證實骨骼肌鈍挫傷成功率達100%。

1.3 藥物干預(yù)

骨骼肌鈍挫傷后即刻，分別于損傷部位進行肌膜外注射黃芪皂甙、丹參酮ⅡA注射液、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液（黃芪皂甙與丹參酮ⅡA注射液各0.5 ml混合，購于上海第一生化有限公司）、黃芪丹參注射液 （丹參注射液與黃芪注射液各0.5 ml混合，購于杭州正大青春寶制藥公司）或生理鹽水，注射劑量均為1 ml/只/次，以后每隔3天注射1次，直至取材。

1.4 實驗取材

分別于損傷后1、4、7、14天隨機取材，6只/次/組。動物用2.5%戊巴比妥鈉麻醉后，迅速取出損傷的腓腸肌，冰預(yù)冷生理鹽水沖洗、濾紙吸干，置液氮中保存。測試前，取出肌肉標本，冰上解凍后，制備10%（w/v）的勻漿，4℃、3500 r/min離心20 min，取上清，－20 ℃保存。

1.5 測試指標與方法

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定采用黃嘌呤氧化酶法；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）活性測定采用谷胱甘肽氧化法；組織蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮蘭法檢測。

上述指標均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒以及美國貝克曼（BECKMAN）公司生產(chǎn)的DU800紫外分光光度計測定，具體方法參照試劑盒說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠腓腸肌鈍挫傷后組織MDA的變化

如表1所示，與生理鹽水對照組相比，第1天各組MDA無明顯差異（P > 0.05），第4天黃芪皂甙組、丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組MDA含量明顯降低（P < 0.05），但黃芪皂甙組下降幅度較小，與黃芪丹參注射液組相比，丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組MDA含量在第4、7天時無顯著差異（P > 0.05）。

表1 各組大鼠腓腸肌鈍挫傷后組織MDA的變化（nmol/mg prot）（n=6）

2.2 大鼠腓腸肌鈍挫傷后組織SOD、GSH-px活性的變化

表2顯示：與生理鹽水對照組相比，黃芪皂甙組、丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組SOD活性在第4、7天明顯升高（P < 0.05），第14天各組間無顯著差異（P > 0.05）；但黃芪皂甙組SOD活性在第4、7天的升高幅度明顯低于丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組（P< 0.05），而丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組之間SOD活性在各時間點無顯著差異（P > 0.05）。

表2 各組大鼠腓腸肌鈍挫傷后組織SOD的變化（U/mg prot）（ n=6）

如表3所示：與生理鹽水對照組相比，黃芪皂甙組、丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組GSH-px活性在第4、7天顯著升高（P < 0.05），第14天各組間無顯著差異（P > 0.05）；但黃芪皂甙組GSH-px活性升高幅度在第4天顯著低于丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組（P < 0.05），而第7天黃芪皂甙組GSH-px活性與丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組相比無顯著差異（P > 0.05）；丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組之間GSH-px活性在各時間點均無顯著差異（P > 0.05）。

3 討論

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所生成的各種脂質(zhì)過氧化物中最重要的一種，是衡量機體自由基代謝水平的敏感指標。機體在正常狀態(tài)下，存在氧化與抗氧化的平衡體系，內(nèi)源性抗氧化酶如SOD可清除氧自由基［6］，從而保護細胞免受損傷。當機體抗氧化體系能力減弱時，大量未及時清除的氧自由基可攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物如MDA生成。SOD活性降低和MDA增加表明了氧自由基大量生成，亦間接地反映了細胞損傷的程度。GSH-px是羥自由基和單線態(tài)氧的清除劑，是體內(nèi)的重要保護因子。因此我們選用MDA和SOD、GSH-px指標反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的變化。

表3 各組大鼠腓腸肌鈍挫傷后組織GSH-px的變化（酶活力單位）（ n=6）

丹參酮ⅡA是“活血化瘀”中藥丹參的脂溶性有效單體，具有抗缺血缺氧，改善微循環(huán)，抑制血小板粘附聚集功能和抗血栓形成的作用。近來大量文獻表明，丹參酮ⅡA是一種新的有效的細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物與DNA相互作用的抑制劑。它對DNA的保護作用很可能通過消除脂類自由基而阻斷脂質(zhì)過氧化的鏈式反應(yīng)，抑制DNA合成物的生成，從而減少了后者的細胞毒性［7］實現(xiàn)。上述研究表明丹參酮ⅡA有促進機體對氧自由基的代謝、降低自由基水平的作用。

本研究也發(fā)現(xiàn)，骨骼肌鈍挫傷后丹參酮ⅡA注射液組、黃芪皂甙+丹參酮ⅡA注射液組、黃芪丹參注射液組MDA含量均降低，表明丹參酮ⅡA能顯著清除氧自由基，減少MDA生成，其機制可能是丹參酮ⅡA抑制DNA生成；而黃芪皂甙組MDA含量明顯高于丹參酮ⅡA注射液，表明黃芪皂甙清除氧自由基的能力明顯弱于丹參酮ⅡA。同時丹參酮ⅡA還可能通過改變抗氧化反應(yīng)防御體系的表達起到抗氧化作用。本研究中，丹參酮ⅡA組SOD活性、GSH-px活性明顯高于黃芪皂甙組及生理鹽水對照組，而黃芪皂甙組SOD活性、GSH-px活性與生理鹽水對照組相比升高不顯著，表明丹參酮ⅡA的抗氧化能力明顯高于黃芪皂甙。我們先前的研究證實了中藥黃芪丹參復(fù)方注射液具有清除氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷的作用［2］，而黃芪皂甙和丹參酮ⅡA是中藥黃芪丹參復(fù)方注射液的主要成分。本研究表明丹參酮ⅡA抗氧化能力及清除氧自由基的能力明顯高于黃芪皂甙，因此，丹參酮ⅡA是中藥黃芪丹參復(fù)方注射液在抗氧化作用方面的主要有效成分。

4 總結(jié)

黃芪皂甙和丹參酮ⅡA都具有減輕骨骼肌鈍挫傷后氧化應(yīng)激損害的作用，但丹參酮ⅡA作用更為顯著。

［1］Toumi H，Best TM. The inflammatory response：friend or enemy for muscle injury? Br J Sports Med，2003，37（4）：284-286.

［2］王茂林，陳世益，李云霞，等. 活血生肌類中藥對大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后氧化應(yīng)激的影響. 中國運動醫(yī)學雜志，2009，28（3）：289-292.

［3］Han JY，F(xiàn)an JY，Horie Y，et al. Ameliorating effects of compounds derived from Salvia miltiorrhiza root extract on microcirculatory disturbance andtarget organ injury by ischemia and reperfusion. Pharmacol Ther，2008，117（2）：280-295.

［4］王娜，朱科，岳華，等. 黃芪總皂甙對心肌細胞氧化損傷的保護作用研究. 河北中醫(yī)藥學報，2007，22（2）：8-9.

［5］Kami K，Masuhara M，Kashiba H，et al. Changes of vinculin and extracellular matrix components following blunt trauma to rat skeletal muscle. Med Sci Sports Exerc，1993，25（7）：832-840.

［6］Nikolaidis MG，Paschalis V，Giakas G，et al. Decreased blood oxidative stress after repeated muscledamaging exercise. Med Sci Sports Exerc，2007，39（7）：1080-1089.

［7］Cao EH，Liu XQ，Wang JJ，et al. Effect of natural antioxidant tanshinone II A on DNA damage by lipid peroxidation in liver cells. Free Radic Biol Med，1996，20（6）：801-806.