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    大孔樹脂對中華常春藤總皂苷的純化研究

    2011-05-12 08:17:58孔令強(qiáng)
    亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2011年10期
    關(guān)鍵詞:樣液總皂苷常春藤

    孔令強(qiáng),劉 明,周 英

    (貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

    常春藤為五加科常春藤[Hedera nepalensis K.Koch.var.sinensis(Tobler)Rehder.]的干燥藤莖、葉[1],常綠攀援藤本。常春藤屬植物莖含鞣質(zhì)、樹脂、皂苷、肌醇、胡蘿卜素等。常春藤屬植物中被研究最多,而且發(fā)現(xiàn)種類較多的一類成分就是皂苷類化合物。該類化合物具有保肝、抗腫瘤、止痙、止痛、殺蟲等多種藥理活性[2]。童星等[3]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定了常春藤揮發(fā)油的化學(xué)成分及其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù),國外研究人員分別從臺灣常春藤、英國常春藤、尼泊爾常春藤中成功分離鑒別出8種齊墩果烷類皂苷7種木栓果烷類皂苷[4]-[6],目前常春藤中所含齊墩果烷型皂苷hederacolchiside A1等被證實(shí)有較強(qiáng)的抗癌活性[7]。本實(shí)驗(yàn)選擇兩種樹脂(AB-8、D101)對常春藤中皂苷的純化進(jìn)行研究,以期獲得皂苷含量較高的部分。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    中華常春藤干燥莖,購于河北安國冷背中藥材市場;常春藤皂苷C,Sigma公司;AB-8、D101型大孔樹脂,南開大學(xué)化工廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;TU-1810紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;FA2004電子分析天平,上海良平儀器儀表有限公司;GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海博達(dá)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理

    將大孔吸附樹脂浸泡在95%乙醇中24h,待其充分溶脹后,用乙醇反復(fù)清洗至流出液加適量蒸餾水無混濁,再用蒸餾水洗盡乙醇,樹脂濕法裝柱后,用2%HCl溶液沖洗,蒸餾水洗至中性后再用5%NaOH溶液沖洗,用水沖洗至中性,樹脂備用。

    1.2.2 樣品的制備方法

    稱取100g常春藤干燥莖,粉碎后以70%乙醇作溶劑,按固液比1∶15加入乙醇,浸泡2h后在50℃水浴中提取2次,每次3h,合并提取液,減壓過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至密度為1.20,將產(chǎn)物依次用石油醚、正丁醇萃取后濃縮并干燥,用甲醇溶解,定容到50mL容量瓶中,即得待測液。

    1.2.3 大孔吸附樹脂對常春藤的靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

    (1)靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)。

    取常春藤總皂苷制備液(2.00mg/mL)50mL裝入錐形瓶中,分別加入2種型號的樹脂各1g,室溫置于搖床上振蕩6h。將充分吸附后的樹脂過濾,置于50mL錐形瓶中,再用70%的乙醇解吸,室溫置于搖床上振蕩6h,測定吸附前后樣液的總皂苷濃度,選出吸附率和解吸率都好的樹脂。按式(1)、式(2)計(jì)算樹脂吸附率和解吸率。

    其中:A為吸附率(%)、B為解吸率(%);C0為起始濃度、C1為平衡濃度、C2為解吸液濃度(mg/mL);V1為吸附液體積、V2為解吸液體積(mL)。

    (2)靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

    稱取10.0gAB-8濕樹脂于500mL錐形瓶中,加入總皂苷濃度為2.00mg/mL的樣液200mL,室溫置于搖床上,震蕩12h,每小時(shí)定時(shí)取樣2.5mL,測定吸附余液總皂苷的濃度,計(jì)算吸附率。

    1.2.4 大孔樹脂對常春藤總皂苷的動態(tài)吸附和解吸

    將預(yù)處理好的AB-8樹脂濕法裝入(1cm×40cm)玻璃層析柱中,將常春藤總皂苷提取液上柱,對上樣流速、濃度、洗脫液濃度及流速等進(jìn)行動態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中待樣液全部通過樹脂柱后,用去離子水洗至流出液無色,再用不同濃度的乙醇以一定速度洗脫,收集洗脫液,測定總皂苷含量。

    1.2.5 中華常春藤總皂苷的測定方法

    采用常春藤皂苷C為對照品香草醛-濃硫酸顯色法。

    (1)試劑的配制。

    ①常春藤皂苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(50μg/mL):準(zhǔn)確稱取一定干燥至恒重的常春藤皂苷C標(biāo)準(zhǔn)品2.5mg,于20mL燒杯中,加入甲醇10mL,微熱使之溶解,用甲醇定容至50mL,搖勻并置于冰箱中保存;②8%香草醛溶液:準(zhǔn)確稱取無水香草醛8g于50mL燒杯中,加50mL蒸餾水溶解后,倒入100mL容量瓶中,定容至刻度,置于棕色瓶中并低溫保存;③77%硫酸溶液:準(zhǔn)確量取蒸餾水21mL于250mL燒杯中,緩慢加入98%H2SO479mL,靜置后倒入100mL容量瓶中并低溫保存。

    (2)樣品的顯色測定法。

    移取2mL待測液于比色管中,烘干溶液加入8%香草醛溶液0.10mL,1min后,加入77%硫酸3.00mL,搖勻,65℃水浴加熱10min,再冰水浴15min,各取1mL移入試管,用77%硫酸定容到10mL,搖勻,靜置10min后以試劑空白作參比,在440nm處測其吸光度。

    (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

    準(zhǔn)確量?。?0μg/mL)常春藤皂苷 C標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00于容量瓶中,其余操作同(2),以試劑空白作參比,在440nm處測其吸光度,結(jié)果見圖1,并以吸光度值(A)為縱坐標(biāo),常春藤皂苷C濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示,求得回歸方程y=0.0636x+0.0108,R2=0.9987。

    圖1 常春藤皂苷C對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1.1 不同樹脂對常春藤總皂苷的吸附率及解吸率

    由圖2可以看出,AB-8樹脂具有較大的吸附率和解吸率,D101樹脂的吸附率相對較低,從綜合上考慮,本實(shí)驗(yàn)確定AB-8樹脂為實(shí)驗(yàn)用樹脂。

    圖2 兩種大孔吸附樹脂的吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1.2 AB-8樹脂對常春藤總皂苷的靜態(tài)吸附動力學(xué)特征

    合適的吸附樹脂除了具有較大的吸附容量、吸附率和解吸率外,同時(shí)還要有較快的吸附速率。實(shí)驗(yàn)對AB-8樹脂進(jìn)行吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖3所示。

    圖3 AB-8樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

    從圖3可以看出,AB-8樹脂對常春藤總皂苷的吸附為平衡型,在6h后基本到達(dá)平衡,到后期雖然有些緩慢下降趨勢,但是起始階段到中后期吸附量都較大,總體上看來,AB-8大孔樹脂對常春藤總皂苷具有良好的吸附動力學(xué)特征,綜合考慮,AB-8大孔樹脂對常春藤總皂苷具有良好的吸附解吸特性,適合常春藤總皂苷的分離純化。

    2.1.3 吸附pH 的影響

    不同pH條件對樹脂吸附常春藤總皂苷的影響,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 不同pH值對常春藤總皂苷吸附率的影響

    從圖4可以看出,pH對吸附率的影響在pH值0~3之間較為明顯,但在pH值3~7影響不明顯,且吸附率普遍較高,常春藤總皂苷提取液的自身濃度為7,在此條件下的吸附率也較高,考慮到實(shí)際操作難易,因此實(shí)驗(yàn)選擇提取液自身的pH條件。

    2.2 AB-8大孔樹脂對常春藤總皂苷的動態(tài)吸附結(jié)果

    2.2.1 上樣流速的影響

    通過調(diào)節(jié)流速對上柱樣液進(jìn)行吸附流速的選擇,上樣濃度均為2mg/mL,制流速分別為1、2、3、4、5、6BV/h,進(jìn)行動態(tài)吸附,六種流速下的吸附率如圖5所示。

    圖5 不同上樣速度對常春藤總皂苷吸附率的影響

    由圖5可知,流速為1BV/h時(shí)吸附率最大,但是1BV/h的流速過慢,上樣時(shí)間長,導(dǎo)致循環(huán)周期延長,考慮到時(shí)間過長會影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度所以選擇3BV/h的流速比較合適。

    治療前,兩組患者的UPDRS II和UPDRS III評分相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;治療后,兩組患者UPDRS II和UPDRS III評分均顯著降低,同組治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且觀察組患者UPDRS II和UPDRS III評分顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    2.2.2 上樣濃度的影響

    通過調(diào)節(jié)上柱樣液濃度分別為1、2、3、4、5、6mg/mL,進(jìn)行吸附濃度的選擇,控制流速為3BV/h進(jìn)行動態(tài)吸附,6種吸附濃度下的吸附率如圖6所示。

    圖6 不同上樣濃度對常春藤總皂苷吸附率的影響

    由圖6可知,隨著上樣濃度的增加,吸附率在不斷增大,當(dāng)上樣濃度達(dá)到2BV/h時(shí)變化很小,且濃度越大越容易出現(xiàn)沉淀并導(dǎo)致柱層析的堵塞,所以選擇上樣濃度為2mg/mL比較合適。

    2.2.3 洗脫液濃度的影響

    分別用10%、30%、50%、70%、90% 的乙醇溶劑進(jìn)行洗脫,解吸流速控制為3BV/h,分別將各次洗脫的組分合并,然后測定它們的吸光度,計(jì)算解吸率,結(jié)果如圖7所示。

    圖7 不同乙醇濃度對常春藤總皂苷吸附率的影響

    2.2.4 洗脫流速的影響

    在確定洗脫劑的最佳濃度后,還需要對洗脫流速進(jìn)行確定,用70%的乙醇洗脫,控制流速分別為1、2、3、4、5、6BV/h,進(jìn)行動態(tài)解吸,六種洗脫流速下的解吸率如圖8所示。

    圖8 不同洗脫速度對常春藤總皂苷吸附率的影響

    由圖8可以看出,以1BV/h和2BV/h的流速進(jìn)行洗脫得到的解吸率均較高,考慮到循環(huán)周期問題,選擇流速較大的2BV/h為宜。

    3 結(jié)論

    通過對所選兩種樹脂對常春藤總皂苷的吸附與解吸性能的研究,確定AB-8樹脂為理想的常春藤總皂苷分離純化的樹脂,其吸附率為72.4%,解吸率為81%,吸附6h達(dá)到平衡。AB-8樹脂對常春藤總皂苷純化的最佳條件為:上柱液pH為7,上柱速度3BV/h,上樣濃度為2mg/mL,以30%乙醇為洗脫液控制洗脫液流速2BV/h。在此條件下,常春藤總皂苷的含量由2%提高到37%,說明AB-8樹脂可有效地分離純化常春藤總皂苷。

    [1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

    [2]DANLOYS Q.Efects of alpha-h(huán)edefin,a saponin extracted from Hedera helix,on cells cultured in vitro[J].Planta Med,1994,60(1):45-49.

    [3]童星,陳曉青.常春藤揮發(fā)油的提取及GC-MS分析[J].精細(xì)化工,2007,24(6):559-561.

    [4]TOMIMORI T.Triterpene glycosides of Hedera taurica[J].生藥學(xué)雜志,1987,41(1):55-57.

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