α7煙堿受體拮抗劑對Aβ蛋白誘導(dǎo)損傷的PC12細胞保護作用的研究☆

汪志剛戚仁斌李衛(wèi)沈文娟張晶趙彥儒朱麗紅陸大祥

·論 著·

α7煙堿受體拮抗劑對Aβ蛋白誘導(dǎo)損傷的PC12細胞保護作用的研究☆

汪志剛*△戚仁斌△李衛(wèi)※沈文娟△張晶△趙彥儒△朱麗紅△陸大祥△

目的 觀察α7煙堿受體拮抗劑對Aβ蛋白誘導(dǎo)損傷的PC12細胞遠期影響，探討其細胞保護的作用。方法 采用高分化的PC12細胞為研究對象，以Aβ25-35制作細胞損傷模型，以煙堿受體激動劑（尼古丁）和α7煙堿受體拮抗劑（甲基牛扁亭堿）進行預(yù)處理。試驗分為4組，分別是：對照組（蒸餾水）、模型組（Aβ25-35）、尼古丁組（尼古丁和Aβ25-35）、甲基牛扁亭堿組（甲基牛扁亭堿和Aβ25-35）。通過 MTT比色法在多個時間點觀察藥物對細胞活力影響的動態(tài)變化，在此基礎(chǔ)上采用流式細胞儀檢測藥物對細胞凋亡和壞死的影響。結(jié)果 在所有時間點，模型組的細胞活力均顯著低于對照組，凋亡和壞死率均高于對照組（P＜0.01）。藥物作用36～60 h，尼古丁組的細胞活力顯著高于模型組和甲基牛扁亭堿組（P＜0.05），凋亡和壞死率較低（P＜0.01）；甲基牛扁亭堿組細胞活力及凋亡和壞死率與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在藥物作用84 h后，與模型組和尼古丁組相比，甲基牛扁亭堿組細胞活力顯著升高，凋亡和壞死率顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論 隨著作用時間的延長（84 h），煙堿受體激動劑（尼古?。C12細胞的保護作用逐漸消失，而α7煙堿拮抗劑（甲基牛扁亭堿）逐漸顯現(xiàn)出細胞保護作用。

β淀粉樣蛋白 PC12細胞 α7煙堿受體拮抗劑 煙堿受體激動劑細胞活力 凋亡

神經(jīng)型煙堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）在腦內(nèi)廣泛分布，與認知和記憶密切相關(guān)。阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）突出的臨床表現(xiàn)是認知和記憶障礙，其重要病理特征是突觸前神經(jīng)元的丟失及其nAChR的減少，其中Aβ蛋白（β-Amyloid peptide）在發(fā)病過程中具有關(guān)鍵的作用［1］。α7型煙堿受體（α7 nAChR）與Aβ蛋白具有高度的親和力［2］，可能介導(dǎo)了Aβ蛋白的神經(jīng)細胞損傷作用。在AD的治療中，乙酰膽堿酯酶抑制劑（acetylcholine esterase inhibitor，AChEI）是最常用的藥物之一，其通過減少激動劑乙酰膽堿的分解起作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，長期應(yīng)用乙酰膽堿酯酶抑制劑其療效逐漸喪失［3－4］，最后無異于安慰劑［5］；長期應(yīng)用煙堿受體激動劑對神經(jīng)細胞是否具有保護作用存在著矛盾的觀點［6－7］。傳統(tǒng)的觀點認為短期應(yīng)用煙堿受體拮抗劑不具有神經(jīng)細胞保護作用［8－9］，而長期應(yīng)用的研究結(jié)果說服力不足［10－11］。既然長期應(yīng)用激動劑存在上述問題，那么長期應(yīng)用煙堿受體拮抗劑可能會產(chǎn)生神經(jīng)細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) PC12細胞是類神經(jīng)元，廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，本實驗高分化的PC12細胞購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心，其表面分布有多種nAChR，其中包括α7 nAChR。細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI-1640，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 藥物與試劑制備 Aβ25-35（Sigma公司）配制母液濃度為1000 μmol／L，使用前置于37℃培養(yǎng)箱孵育3～7 d老化，作用濃度為10 μmol／L；尼古?。╪icotine，日本和光純藥株式會社）配制母液濃度2000 μmol／L，作用濃度100 μmol／L；甲基牛扁亭堿 （methyllycaconitine，Sigma公司）配制母液濃度200 μmol／L，作用濃度10 μmol／L；二者加入到培養(yǎng)液中的體積相等。

1.3 實驗分組與藥物處理 試驗分為4組：對照組（加蒸餾水）、模型組（加 Aβ25-35）、尼古丁組（尼古丁預(yù)處理，12 h后再加 Aβ25-35）、甲基牛扁亭堿組（甲基牛扁亭堿預(yù)處理，12 h后再加Aβ25-35）。細胞活力檢測：同時接種 5個 96孔培養(yǎng)板，細胞接種密度 500／孔；接種后約 24 h加入相應(yīng)的藥物預(yù)處理；12 h后全量換液加入Aβ25-35和相應(yīng)的藥物；每隔 24～36 h半量換液，并補充 Aβ25-35和相應(yīng)的藥物；分別于首次加藥后 36、48、60、72、84 h進行細胞活力檢測。細胞凋亡檢測：同時接種2個24孔培養(yǎng)板；36 h實驗細胞接種密度為20000／孔，84 h實驗細胞接種密度為 1000／孔；藥物處理方法同上；分別于首次加藥后36 h和 84 h檢測凋亡和壞死率。

1.4 檢測方法 細胞活力檢測：采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT；Sigma）比色法檢測，濃度為5 mg／mL；每孔加入20 μL，在37℃培養(yǎng)箱孵育4 h；輕柔吸凈培養(yǎng)孔中的液體，加入二甲基亞砜 （dimethyl Sulfoxide，DMSO；sigma）；震蕩10 min，用多功能全波長酶標儀（瑞士Tecan公司）測定光吸收值（570 nm波長）。凋亡檢測：消化收集處理后的細胞，PBS洗滌 2次，離心（2000 rpm，5 min）；調(diào)整的細胞數(shù)目為1～5×105，加入500 μL的Binding Buffer以懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）混勻后，再加入5 μL碘化丙啶（Propidium，PI；南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min；在1 h內(nèi)用FACS Aria流式細胞儀（美國BD公司）檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm；重復(fù)5次實驗。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析和處理實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析和LSD檢驗，檢驗水準α＝0.05。

表1 尼古丁或甲基牛扁亭堿作用不同時間后對PC12細胞活力的影響（±s）

表1 尼古丁或甲基牛扁亭堿作用不同時間后對PC12細胞活力的影響（±s）

1）與空白對照組比較，經(jīng)LSD檢驗，P＜0.012）與模型組和甲基牛扁亭堿組比較，經(jīng)LSD檢驗，P＜0.053）與模型組和尼古丁組比較，經(jīng)LSD檢驗，P＜0.01

組別對照組模型組尼古丁組甲基牛扁亭堿組n 10 10 10 10 36 h 0.50±0.06 0.27±0.031）0.40±0.062）0.29±0.04 48 h 0.64±0.01 0.33±0.021）0.44±0.032）0.35±0.02 60 h 0.74±0.03 0.44±0.031）0.47±0.032）0.44±0.02 72 h 0.84±0.02 0.52±0.031）0.52±0.03 0.53±0.03 84 h 0.91±0.04 0.60±0.031）0.58±0.02 0.66±0.053）

圖1 尼古丁或甲基牛扁亭堿對PC12細胞活力影響的動態(tài)變化趨勢

表2 尼古丁或甲基牛扁亭堿作用于PC12細胞36 h和84 h后細胞的凋亡和壞死率比較

2 實驗結(jié)果

2.1 尼古丁或甲基牛扁亭堿在不同時間點對PC12細胞活力的影響及其變化趨勢 （見表1，圖1）表1結(jié)果顯示：在所有時間點，Aβ25-35組的細胞活力均顯著低于對照組 （P＜0.01）。在36～60 h，尼古丁組細胞活力顯著高于模型組和甲基牛扁亭堿組（P＜0.05）；甲基牛扁亭堿組與模型組的細胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在72 h，模型組、尼古丁組和甲基牛扁亭堿組之間的細胞活力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。在84 h，甲基牛扁亭堿組的細胞活力顯著高于模型組和尼古丁組（P＜0.01）。

圖1結(jié)果提示：由于PC12細胞的具有增殖性，所以所有組別的細胞活力都是增加的。在所有時間點，模型組的細胞活力均明顯低于對照組。尼古丁組細胞活力上升最為緩慢，最后甚至低于模型組；甲基牛扁亭堿組細胞活力上升最快，最后高于模型組和尼古丁組。

2.2 尼古丁或甲基牛扁亭堿作用于PC12細胞36和84 h后對細胞凋亡和壞死的影響 圖2、3和表2結(jié)果提示：在兩個時間段，模型組的細胞凋亡和壞死率均顯著低于對照組（P＜0.01）。在36 h，尼古丁組的細胞凋亡和壞死率均顯著低于模型組和甲基牛扁亭堿組（P＜0.01）；甲基牛扁亭堿組的細胞凋亡和壞死率與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在8 4 h，尼古丁組的細胞凋亡和壞死率與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；甲基牛扁亭堿組細胞凋亡和壞死率均顯著低于模型組和尼古丁組（P＜0.01）。

3 討論

Aβ蛋白可以誘導(dǎo)神經(jīng)細胞的凋亡，在AD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［12］。Aβ蛋白常常用于制作動物［13］或者細胞模型，用于AD的研究。有研究發(fā)現(xiàn)Aβ蛋白與α7 nAChR具有高度親和力，Aβ蛋白在神經(jīng)細胞內(nèi)沉積可能與α7nAChR有關(guān)［2］。本實驗發(fā)現(xiàn)Aβ25-35可引起PC12細胞活力下降，凋亡和壞死增加，為實驗成功復(fù)制了Aβ蛋白的損傷模型。

本實驗發(fā)現(xiàn)藥物作用較短時間 （36～60 h）后，尼古丁可以對抗Aβ25-35的作用，提高PC12細胞的活力，抑制細胞的凋亡和壞死，具有細胞保護作用；同時，也發(fā)現(xiàn)在較短時間（36～60 h）的藥物作用后，甲基牛扁亭堿未增加細胞活力，也未抑制細胞的凋亡。這些與以前的研究是一致的，同樣采用PC12細胞，有研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿類似物作用48 h，增加了細胞的活力［8］。還有采用SH-SY5Y細胞，用魚藤酮毒和寡霉素A作用8 h，再加入α7煙堿受體激動劑作用16 h，細胞活力升高、凋亡壞死下降［9］。與激動劑相反，傳統(tǒng)的觀點認為煙堿受體拮抗劑不具有細胞保護作用，并且可能會阻斷激動劑的保護作用［8－9］。

圖2 流式細胞儀檢測尼古丁或甲基牛扁亭堿作用36 h后的PC12細胞凋亡和壞死（各組PC12細胞凋亡和壞死率：A，對照組2.5%和3.2%；B，模型組8.9%和23.7%；C，尼古丁組2.7%和12.6%；D，甲基牛扁亭堿組7.3%和19.6%。

圖3 流式細胞儀檢測尼古丁或甲基牛扁亭堿作用84 h后PC12細胞的凋亡和壞死（各組PC12細胞凋亡和壞死率：A，對照組10.3%和7.2%；B，模型組51.0%和14.0%；C，尼古丁組51.5%和15.2%；D，甲基牛扁亭堿組41.2%和13.8%

但是在藥物作用84 h后，與模型組相比，尼古丁組的細胞活力下降，凋亡和壞死增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；此時，與模型組和尼古丁組相比，甲基牛扁亭堿組的細胞活力顯著較高，凋亡和壞死率顯著較低。說明隨著作用時間的延長，尼古丁對PC12細胞保護作用逐漸喪失，而甲基牛扁亭堿逐漸表現(xiàn)出細胞保護的作用。既往的文獻報道，長期應(yīng)用煙堿受體激動劑對神經(jīng)細胞是否具有保護作用的觀點存在著分歧。有研究認為長時間應(yīng)用尼古丁（15 d）具有損傷神經(jīng)細胞的作用［14］，也有研究認為尼古丁具有保護神經(jīng)細胞的作用 （時間最長達6個月）［6－7］。根據(jù)本實驗的結(jié)果，尼古丁的細胞保護作用隨著作用時間的延長而消失，目前機理還不明確。有學(xué)者認為，尼古丁既可以促進細胞存活，也可以導(dǎo)致細胞凋亡，表現(xiàn)為促進存活和凋亡的兩面性，和作用時間長短有一定關(guān)系［15］。Hu等［10］發(fā)現(xiàn)，Aβ蛋白早期僅僅影響神經(jīng)元軸突的生長，而不影響細胞凋亡，用α7受體激動劑和拮抗劑預(yù)處理（6～9 d），均可以抑制Aβ蛋白的這種毒性作用。Mousavi等［11］在SH-SY5Y和M10細胞的實驗中發(fā)現(xiàn)，用甲基牛扁亭堿和銀環(huán)蛇毒（α-bungarotoxin）作用72 h，降低了Aβ蛋白的水平。此外，Martin等［16］在體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元的實驗中發(fā)現(xiàn)，以甲基牛扁亭堿作用48 h，細胞活力是升高的。目前關(guān)于較長時間應(yīng)用煙堿受體拮抗劑具有神經(jīng)細胞保護作用的報道還較少，所觀察到的結(jié)果僅僅是對軸突生長和Aβ蛋白水平的影響，或者檢測指標過于簡單（僅僅檢測MTT）。但是，既然在AD的發(fā)病中，Aβ蛋白起到重要作用，并且Aβ蛋白在神經(jīng)細胞內(nèi)的沉積與α7煙堿受體可能有關(guān)；那么，α7煙堿受體拮抗劑通過阻斷α7煙堿受體，可能會阻止Aβ蛋白對神經(jīng)細胞的損傷，這些與本實驗的結(jié)果是相符的。

在同樣為受體的研究中，β受體激動劑短期治療心衰有效，但長期用藥卻有害；而短期用β受體阻滯劑可能加重病情，長期用藥卻獲益。與此類似，長期應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑（抑制激動劑乙酰膽堿分解）治療AD，其療效逐漸下降，最終無異于安慰劑［17］。并且，慢性心功能不全和AD具有類似的發(fā)病機制，如興奮性的刺激、受體下調(diào)和減少、細胞凋亡。

綜上所述，長期應(yīng)用煙堿受體激動劑 （尼古丁）對PC12細胞的保護作用逐漸消失，是否具有不利的影響需要進一步研究；而長期應(yīng)用α7煙堿受體拮抗劑（甲基牛扁亭堿）其細胞保護作用逐漸表現(xiàn)出來。結(jié)合文獻報道，在AD治療中，長期應(yīng)用煙堿受體激動劑可能并不適宜，而α7煙堿受體拮抗劑可能成為一種好的選擇，但還需要更多的證據(jù)。

［1］ 陳祥，鐘翎.阿爾茨海默病中β淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性作用研究進展［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2008，34（5）：315－317.

［2］Wang HY LD，Davis CB，Shank RP.Amyloid Peptide Ab1-42 Binds Selectively and with Picomolar Affinity to α7 Nicotinic Acetylcholine Receptors［J］.J Neurochem，2000，75（3）：1155－1161.

［3］Rogers SL，F(xiàn)arlow MR，Doody RS，et al.A 24-week，double-blind，placebo-controlled trial of donepezil in patients with Alzheimer's disease.Donepezil Study Group［J］.Neurology，1998，50（1）：136－145.

［4］Rogers SL，Doody RS，Mohs RC，et al.Donepezil improves cognition and global function in Alzheimer disease： a 15-week，double-blind，placebo-controlled study.Donepezil Study Group［J］.Arch Intern Med，1998，158（9）：1021－1031.

［5］Petersen RC TR，Grundman M，Bennett D，et al.Alzheimer's Disease Cooperative Study Group.Vitamin E and donepezil for the treatment of mild cognitive impairment［J］.N Engl J Med，352（23）：2379－2388.

［6］Shim SB，Lee SH，Chae KR，et al.Nicotine Leads to Improvements in Behavioral Impairment and an Increase in the Nicotine Acetylcholine Receptor in Transgenic Mice［J］.Neurochemical Research，2008，33（9）：1783－1788.

［7］Marighetto A，Valerio S，Desmedt A，et al.Comparative effects of the α7 nicotinic partial agonist，S 24795，and the cholinesterase inhibitor，donepezil，against aging-related deficits in declarative and working memory in mice［J］.Psychopharmacology，2008，197（3）：499－508.

［8］Jonnala RR，Graham JH，Terry Jr AV，et al.Relative levels of cytoprotection produced by analogs of choline and the role of α7-nicotinic acetylcholine receptors［J］.Synapse，2003，47（4）：262－269.

［9］Parada E，Egea J，Romero A，et al.Poststress treatment with PNU282987 can rescue SH-SY5Y cells undergoing apoptosis via α7 nicotinic receptors linked to a Jak2／Akt／HO-1 signaling pathway［J］.Free Radical Biology and Medicine，2010，49（11）：1815－1821.

［10］Hu M，Schurdak M，Puttfarcken P，et al.High content screen microscopy analysis of Aβ1-42-induced neurite outgrowth reduction in rat primary cortical neurons：Neuroprotective effects of α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor ligands［J］.Brain Research，2007，1151：227－235.

［11］Mousavi M，Hellstr?m-Lindahl E.Nicotinic receptor agonists and antagonists increase sAPPα secretion and decrease Aβ levels in vitro［J］.Neurochemistry International，2009，54（3－4）：237－244.

［12］Viana RJ RR，Nunes AF，Steer CJ，et al.Modulation of Amyloid PeptideInduced Toxicity through Inhibition of JNK Nuclear Localization and Caspase2 Activation［J］.J Alzheimers Dis，2010，22（2）：557－568.

［13］佡劍非，陳紅，任常山.β－淀粉蛋白腦室內(nèi)注射建立阿爾茨海默病大鼠模型［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2005，31（2）：145－147.

［14］Oliveira-da-Silva A，Manhaes AC，Cristina-Rodrigues F，et al.Hippocampal increased cell death and decreased cell density elicited by nicotine and／or ethanol during adolescence are reversed during drug withdrawal［J］.Neuroscience，2010，167（1）：163－173.

［15］Oloris SC，F(xiàn)razer-Abel AA，Jubala CM，et al.Nicotine-mediated signals modulate cell death and survival of T lymphocytes［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2010，242（3）：299－309.

［16］Martin S，Defiebre N，Defiebre C.The α7 nicotinic acetylcholine receptor-selective antagonist，methyllycaconitine，partially protects against β-amyloid toxicity in primary neuron-enriched cultures［J］.Brain Research，2004，1022（1－2）：254－256.

［17］Petersen RC，Thomas RG，Grundman M，et al.Vitamin E and donepezil for the treatment of mild cognitive impairment［J］.N Engl J Med，2005，352（23）：2379－2388.

（責任編輯：李 立）

The study on protective effect of α7 nicotinic antagonist on PC12 cell injury induced by β-Amyloid peptides.

WANG Zhigang，QI Renbing，LI Wei，SHENG Wenjuan，ZHANG Jin，ZHAO Yanru，ZHU Lihong，LU Daxiang.Department of Critical Care Medicine，The First Affiliated Hospital，Jinan University，No.613 Huangpu Avenue West，Guangzhou 510630，China.Tel：020－38688319.

Objective To observe the long term effect of chronic administration of α7 nicotinic antagonist on PC12 cells injury induced by β-Amyloid peptides.Methods Well-differentiated PC12 cells were exposed to Aβ25-35 to create PC12 cell injury model and nicotine and methyllycaconitine were administrated before PC12 cell injury.The experimental groups were divided as follows：control（Distilled Water），model group（Aβ25-35），nicotine group（nicotine and Aβ25-35） and methyllycaconitine group （methyllycaconitine and Aβ25-35）.The cellar viability was detected using MTT chromatometry and the apoptosis and necrosis was detected by flow cytometer.Results Compared with control group，the cellular viability was decreased and apoptotic and necrotic rates were increased at every phase in model group（P＜0.01）.Compared with model and methyllycaconitine groups，the cellular viability was increased（P＜0.05）and apoptotic and necrotic rate were decreased in nicotine group（P＜0.01）between 36 and 60 h following treatment.There were no significant changes in cellular viability and apoptotic as well as necrotic rates between model and methyllycaconitine groups between 36 to 60 h following treatment.When treatment was prolonged to 48 h，there were no significant differences in cellular viability and apoptotic as well as necrotic rates between nico-tine and model groups.However，treatment with Methyllycaconitine for 48 h significantly increased cell viability and decreased apoptotic and necrotic rates compared with either model or nicotine groups （P＜0.01）.Conclusions When treatment is prolonged，the protective effect of nicotinic agonist（nicotine）decreases whereas the protective effect of α7 nicotinic antagonist（methyllycaconitine）increases.

β-Amyloid peptides PC12 cells nicotinic agonist nicotinic antagonist cellar viability apoptosis

R363

A

2011－02－25）

☆ 廣東省自然科學(xué)基金項目（編號：845106320100363），暨南大學(xué)科研培育與創(chuàng)新基金前瞻性與基礎(chǔ)研究項目（中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助，編號：21609425）

* 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院危重病醫(yī)學(xué)科（廣州 510630）

△ 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，國家中醫(yī)藥管理局病理生理重點實驗室

（E-mail：ldx＠jnu.edu.cn）

※ 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科