多巴胺D1受體激動(dòng)劑SKF38393對(duì)剝奪血清條件下PC12細(xì)胞的保護(hù)作用☆

王雪汪海濤任艷囡鄭文華

·論 著·

多巴胺D1受體激動(dòng)劑SKF38393對(duì)剝奪血清條件下PC12細(xì)胞的保護(hù)作用☆

王雪*汪海濤*任艷囡*鄭文華*

目的 研究多巴胺D1受體激動(dòng)劑SKF38393對(duì)剝奪血清所致PC12細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其與磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinases／protein kinase B，PI3K／Akt）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）信號(hào)通路的關(guān)系。方法 將PC12細(xì)胞分為血清剝奪模型組、血清剝奪后加不同劑量SKF38393處理組（1 μmoL、3 μmoL、10 μmoL、30 μmoL和100 μmoL）及1%胎牛血清對(duì)照組，比較各組PC12細(xì)胞活性；PC12細(xì)胞分別加入不同劑量（同上）SKF38393處理40 min，以及以10 μmoL SKF38393處理不同時(shí)間（5～80 min），然后檢測(cè)PC12細(xì)胞的Akt473及ERK1／2的磷酸化水平；PC12細(xì)胞分別加入PI3K／Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002（50 μmoL）、ERK信號(hào)通路抑制劑PD98059（50 μmoL）或PD169316（10 μmoL），后再行SKF38393干預(yù)，比較各組PC12細(xì)胞活性。結(jié)果 與剝奪血清組比較，10 μmoL SKF38393即可顯著增加PC12細(xì)胞的活性［（0.58±0.02）vs（0.37±0.01）］，并且隨著其劑量（30 μmoL、100 μmoL）的增加PC12細(xì)胞活性的增加可更明顯［（0.62±0.01）、（0.65±0.02）］，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同劑量SKF38393和不同時(shí)間的SKF38393處理PC12細(xì)胞后磷酸化的Akt和ERK的表達(dá)水平均明顯高于剝奪血清組 （P＜0.05）。與SKF38393組的PC12細(xì)胞活性（0.59±0.01）比較，PD169316組細(xì)胞活性（0.41±0.14）無(wú)明顯差異（P＞0.05），但LY294002組 （0.33±0.01）和PD98059（0.33±0.03）組細(xì)胞活性均更低 （P＜0.05），提示僅后二者可阻斷SKF38393對(duì)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)論 SKF38393能保護(hù)剝奪血清所致的PC12細(xì)胞損傷，其保護(hù)作用可能與激活PI3K／Akt和ERK信號(hào)通路有關(guān)。

PC12細(xì)胞 多巴胺D1受體激動(dòng)劑 SKF38393 磷脂酰肌醇－3激酶／蛋白激酶B 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶

中腦黑質(zhì)多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)元缺失導(dǎo)致帕金森氏?。╬arkinson’s diseases，PD）臨床癥狀的產(chǎn)生［1－2］，而越來(lái)越多的研究證明DA神經(jīng)元缺失發(fā)生的根本原因是多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行性凋亡［3］。目前臨床中使用多巴胺受體激動(dòng)劑治療PD有效，但其作用機(jī)制仍不清楚。近年研究提示多巴胺受體激動(dòng)劑除具有激動(dòng)多巴胺受體的作用外，還可能具有神經(jīng)保護(hù)作用［4］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular signal-regulated kinases，ERK）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的促存活信號(hào)通路，Akt及ERK磷酸化水平的增加可對(duì)抗神經(jīng)元凋亡并促進(jìn)神經(jīng)元存活［5］。那么，多巴胺受體激動(dòng)劑是否可對(duì)抗細(xì)胞凋亡？而且其作用機(jī)制是否與Akt及ERK信號(hào)通路相關(guān)？目前尚未見(jiàn)報(bào)道，但上述問(wèn)題的探討具有明顯的臨床意義。本研究以PC12細(xì)胞建立細(xì)胞凋亡模型，并考察D1受體激動(dòng)劑SKF38393是否具有神經(jīng)保護(hù)作用及其作用的可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1 材料與方法

1.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng) PC12細(xì)胞由加拿大McGill大學(xué)Douglas Institute Dr.Remi Quirion惠贈(zèng)，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、馬血清、抗生素和Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）均購(gòu)自英韋創(chuàng)津公司（GIBCO）。以含5%FBS、5%馬血清和0.2%抗生素的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)PC12細(xì)胞；細(xì)胞為上皮樣貼壁生長(zhǎng)，每2 d～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞處理前24 h以含1%胎牛血清的DMEM接種于多聚賴氨酸包被過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2 PC12細(xì)胞分組及細(xì)胞處理

1.2.1 SKF38393對(duì)細(xì)胞活性的影響 PC12細(xì)胞分為：①血清剝奪模型組：剝奪培養(yǎng)基中胎牛血清及馬血清，造成PC12細(xì)胞損傷；②5個(gè)SKF38393處理組：不含血清但含有不同濃度的SKF38393（1 μmoL、3 μmoL、10 μmoL、30 μmoL、100 μmoL）；③1%FBS對(duì)照組。每組細(xì)胞設(shè)置 5個(gè)復(fù)孔，SKF38393處理 24 h后測(cè)定細(xì)胞活性，考察SKF38393對(duì)血清剝奪細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1.2.2 SKF38393對(duì)Akt及ERK信號(hào)通路影響的量效及時(shí)效關(guān)系 考察SKF38393對(duì)Akt及ERK信號(hào)通路影響的量效關(guān)系時(shí)，PC12細(xì)胞分為加入不同劑量SKF38393（1 μmoL～100 μmoL）組和不加入SKF38393處理組，處理40 min后檢測(cè)Akt473及ERK1／2的磷酸化水平?？疾霺KF38393對(duì)Akt及ERK信號(hào)通路影響的時(shí)效關(guān)系時(shí)，PC12細(xì)胞分為加入10 μmoL SKF38393不同時(shí)間處理組和不加SKF38393對(duì)照組，處理組的時(shí)間分別為0 min～80 min。處理結(jié)束后檢測(cè)Akt及ERK的磷酸化水平。

1.2.3 PI3K／Akt及 ERK1／2信號(hào)通路抑制劑對(duì)SKF38393保護(hù)作用的影響 PC12細(xì)胞分為剝奪血清組、SKF38393（30 μmoL）組、PI3K／Akt抑制劑LY294002（50 μmoL）加SKF38393（30 μmoL）處理組、ERK抑制劑PD98059（50 μmoL）加SKF38393（30 μM）處理組、1%FBS對(duì)照組。每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，處理結(jié)束后檢測(cè)細(xì)胞活性，考察SKF38393作用的信號(hào)通路。SKF38393、LY294002、PD98059、PD169316均購(gòu)自美國(guó)的Sigma-Aldrich公司。

1.3 PC12細(xì)胞活性的檢測(cè) 采用四甲基偶氮唑鹽比色法（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）。將接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的PC12細(xì)胞抽去上清液，每孔加入100 μL MTT溶液（0.5 mg／mL）繼續(xù)培養(yǎng)3 h，抽去上清液后于每孔加入100 μL二甲基亞砜振搖20 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度。細(xì)胞活性以490 nm處吸光度值表示。

1.4 Akt及ERK磷酸化水平的檢測(cè) 采用Western blot法，重復(fù)檢測(cè)3次。將收集的PC12細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量后，等量蛋白的樣品（50 μg）上樣，進(jìn)行10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺電泳，電泳結(jié)束后100 V電壓轉(zhuǎn)印90 min，5%脫脂奶粉 TBST溶液室溫封閉1 h。TBST清洗后加入1∶1000比例稀釋的一抗：磷酸化的ERK1／2抗體、磷酸化的Akt抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（均購(gòu)自美國(guó)的Santa Cruz公司），4℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入1∶5000比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后洗膜。經(jīng)化學(xué)熒光試劑顯影 （Paul），在暗室中用X光膠片壓片成像。掃描膠片后應(yīng)用Image-J進(jìn)行條帶灰度分析，以p-Akt及p-ERK1／2條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示各組PC12細(xì)胞中p-Akt及p-ERK1／2的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用最小顯著差值法 （least significant different，LSD）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SKF38393對(duì)細(xì)胞活性的影響 剝奪血清模型組、不同劑量SKF38393組與1%FBS對(duì)照組之間的吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F＝107.41，P＜0.05）。兩兩比較顯示，剝奪血清模型組明顯低于1%FBS組（P＜0.05），而3 μmoL、10 μmoL、30 μmoL和100 μmoL SKF38393處理后各組的吸光度值均明顯高于剝奪血清組（P＜0.05）。

2.2 SKF38393對(duì)PC12細(xì)胞胞內(nèi)Akt、ERK磷酸化的影響 5個(gè)不同時(shí)間的SKF38393處理組與不加SKF38393的對(duì)照組之間Akt和ERK磷酸化水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝21.83，P＜0.05；F＝93.10，P＜0.05）。與對(duì)照組比較，10 μmoL的SKF38393處理10 min、20 min、40 min、80 min可以明顯增加Akt和ERK的磷酸化水平（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 不同劑量SKF38393對(duì)剝奪血清后PC12細(xì)胞活性的影響

表2 SKF38393對(duì)PC12細(xì)胞胞內(nèi)Akt和ERK磷酸化影響的時(shí)間關(guān)系

不同劑量的 SKF38393處理組與不加SKF38393的對(duì)照組相比，Akt和ERK磷酸化水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F＝99.32，P＜0.05；F＝31.32，P＜0.05）。1、3、10、30、100 μmoL不同劑量SKF38393處理40 min后均可以明顯增加Akt和ERK的磷酸化水平 （P＜0.05），并在 30～100 μmoL時(shí)達(dá)到最大值。見(jiàn)表3。為保證結(jié)果穩(wěn)定性，后續(xù)不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)SKF38393保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)，我們采用30 μmoL SKF38393處理細(xì)胞。

2.3不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)SKF38393保護(hù)作用的影響 剝奪血清模型組、不同信號(hào)通路抑制劑組、SKF38393組與1%FBS對(duì)照組之間的吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝93.02，P＜0.05）。與1%FBS對(duì)照組比較，剝奪血清模型組細(xì)胞吸光度值下降（P＜0.05）；與剝奪血清模型組比較，給予SKF38393處理后細(xì)胞存活率明顯增加（P＜0.05）；而給予PI3K／Akt信號(hào)通路抑制劑 LY294002、ERK信號(hào)通路抑制劑PD98059后均可明顯抑制SKF38393的保護(hù)作用（P＜0.05），但P38MAPK抑制劑PD169316則沒(méi)有明顯作用（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表3 SKF38393對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)Akt和ERK磷酸化影響的量效關(guān)系

表4 不同信號(hào)通路抑制劑對(duì)SKF38393保護(hù)作用的影響

3 討論

本研究通過(guò)剝奪血清建立PC12細(xì)胞損傷模型，在此基礎(chǔ)上考察了SKF38393對(duì)剝奪血清引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步考察了其作用的信號(hào)通路。PC12細(xì)胞是神經(jīng)科學(xué)離體研究神經(jīng)元的一種重要工具細(xì)胞［6］，在藥物、毒物等化學(xué)物質(zhì)的作用下以及缺乏神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子條件下，都可發(fā)生凋亡的損傷［7］。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)剝奪血清模擬PD發(fā)病機(jī)制中的凋亡狀態(tài)，血清剝奪所引起的細(xì)胞損傷模型已被廣泛用于藥物對(duì)細(xì)胞凋亡損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的研究［11］。

SKF38393是選擇性的多巴胺D1受體激動(dòng)劑，臨床上具有良好的抗帕金森病的作用并可減少左旋多巴治療所引起的副作用［8］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與剝奪血清模型組比較，SKF38393可以顯著對(duì)抗血清剝奪所引起的細(xì)胞損傷。在此之前已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)SKF38393可以對(duì)抗大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中N-甲基天冬氨酸受體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性以及氧化應(yīng)激引發(fā)的神經(jīng)損傷［9－10］。這一結(jié)果與本研究結(jié)果類似，都提示了SKF38393的神經(jīng)保護(hù)作用。

為進(jìn)一步探討SKF神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，本研究考察了SKF38393對(duì)促存活激酶Akt及ERK磷酸化水平的影響，并通過(guò) PI3K／Akt抑制劑LY294002、ERK抑制劑PD98059及p38MAPK抑制劑PD169316進(jìn)一步考察SKF38393起作用的信號(hào)通路。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SKF38393可以顯著增加Akt和ERK的磷酸化水平，加入Akt及ERK的抑制劑后均可顯著減弱SKF38393的神經(jīng)保護(hù)作用，進(jìn)一步提示SKF38393可以通過(guò)或者是部分通過(guò)激活PI3K／Akt及ERK信號(hào)通路而對(duì)抗剝奪血清所誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，而p38MAPK信號(hào)通路的抑制劑則未能有效阻斷SKF38393的神經(jīng)保護(hù)作用。與本研究結(jié)果相似，在紋狀體神經(jīng)元上的研究發(fā)現(xiàn)多巴胺激活D1受體后以及SKF38393刺激可引起ERK信號(hào)通路激活［11］。同樣SKF38393可以促使紋狀體神經(jīng)元TrkB受體在細(xì)胞膜表面表達(dá)增加，從而活化Akt及ERK［12］。本研究結(jié)果則在凋亡模型上進(jìn)一步深入考察了SKF38393對(duì)血清剝奪所致凋亡的保護(hù)作用。

Akt及ERK均是重要的抗凋亡激酶，當(dāng)Akt及ERK發(fā)生磷酸化后被激活，激活的Akt促使底物蛋白特定部位位點(diǎn)磷酸化，從而導(dǎo)致細(xì)胞存活增殖，并保護(hù)細(xì)胞逃避凋亡［13］。SKF38393促進(jìn)Akt和ERK的磷酸化水平，活化的Akt及ERK可進(jìn)一步作用于下游關(guān)鍵的凋亡蛋白［14］，使它們磷酸化進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡的生物學(xué)功能。但SKF38393促進(jìn)Akt及ERK磷酸化的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，Akt及ERK均是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 （BDNF）等的重要下游靶分子，SKF38393增加Akt及ERK的磷酸化是增加細(xì)胞表面神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的表達(dá)，還是具有激動(dòng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體的作用，還是有其他的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡作為致病因子已被廣泛證實(shí)參與帕金森病的發(fā)病過(guò)程。隨著相關(guān)研究的逐步深入，神經(jīng)保護(hù)的治療策略越來(lái)越受到重視，有效的神經(jīng)保護(hù)策略將明顯挽救神經(jīng)元［15］。本研究初步揭示了SKF38393對(duì)血清剝奪所誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制，提示D1受體激動(dòng)劑的神經(jīng)保護(hù)作用可能和帕金森病的治療有關(guān)，為SKF38393應(yīng)用于帕金森病的治療提供了新的證據(jù)，但這一作用還有待在動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Dopamine-1 receptor agonist SKF38393 protects PC12 cell against death induced by serum deprivation via PI3K／Akt pathway.

WANG Xue，WANG Haitao，REN Yannan，ZHENG Wenhua.Neuropharmacology，School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University.Guangzhou 510006.China.Tel：020－39943103.

Objective To study the protective effects of dopamine-1 receptor（D1）agonist SKF38393 on PC12 cells against serum deprivation and its potential protective mechanisms associated with phosphatidylinositol 3-kinases／protein kinase B（PI3K／Akt）and extracellular signal-regulated kinases（ERK）signal pathways.Methods PC12 cells were divided into serum-free group，SKF38393 treatment groups（1 μmoL、3 μmoL、10 μmoL、30 μmoL and 100 μmoL）and 1%fetal bovine serum（FBS）group.PC12 cells were treated with various concentrations（1～100 μmoL）of SKF38393 for 40 min and 10 μmoL SKF38393 for various times（0～80 min）.PC12 cells were treated with PI3K／Akt signal pathway inhibitor LY294002（50 μmoL）and ERK signal pathway inhibitors PD98059（50 μmoL）、PD169316（10 μmoL） before the addition of SKF38393 into the culture medium.Cell viability and levels of phsophorylated Akt and ERK were analyzed using MTT and Western blot，respectively.Results Compared with serum deprivation group，10 μmoL SKF38393 could significantly increase cell viability ［（0.58±0.02） vs （0.37±0.01）］， protective effects ofSKF38393 gradually increased［（0.62±0.01），（0.65±0.02）］as the concentrations increased（30 μmoL，100 μmoL）（P＜0.05）.Compared with serum deprivation group， the levels of phosphorylated Akt and ERK were significantly increased after treatment with the different concentrations of SKF38393 or treatment with SKF38393 for various times（P＜0.05）.Compared with the cell viability in SKF38393 group（0.59±0.01），the protective effect of SKF38393 was inhibited by LY290002（0.33±0.01）or PD98059（0.33±0.03）（P＜0.05），but not PD169316（0.41±0.14）（P＞0.05）.Conclusion SKF38393 can protect PC12 cells against the injury induced by serum deprivation through， at least in part，PI3K／Akt and ERK pathways.

PC12 cells Dopamine-1 receptor agonist SKF38393 Phosphatidylinositol 3-kinases／protein kinase B（PI3K／Akt） Extracellular signal-regulated kinases（ERK）

R749.3

A

2011－02－21）

（責(zé)任編輯：曹莉萍）

☆ 國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30670652、30711120565、30970935）

* 中山大學(xué)藥學(xué)院神經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)室（廣州 510006）

（E-mail：whzheng1231＠gmail.com）