參力加顆粒劑對(duì)心力衰竭大鼠心肌MMP－9表達(dá)的影響

隋博文姜德友解 穎陳 飛

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040

心力衰竭 (Heart Fai1ure)是由多種病因引起的心肌收縮功能和/或舒張功能障礙的病理綜合癥，其復(fù)雜的病理生理機(jī)制尚未徹底闡明。參力加顆粒是課題組治療心力衰竭的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用多年，療效確切、可靠。前期實(shí)驗(yàn)證明其有良好的擴(kuò)張血管、降壓利尿、增加心肌收縮力、減輕心室重構(gòu)、改善心功能等藥理作用。蛋白芯片能夠在一次實(shí)驗(yàn)中平行高通量地比較幾十或幾百種細(xì)胞中重要功能蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。能夠從多通路、細(xì)胞分子和整體水平揭示疾病的發(fā)生發(fā)展與治療機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)蛋白抗體芯片技術(shù)篩查參力加顆粒對(duì)心力衰竭大鼠心臟功能蛋白的表達(dá)，以期從細(xì)胞分子和整體水平揭示參力加顆粒對(duì)心力衰竭大鼠心臟的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康Wister大鼠70只，雄性，體重250±5g。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫20～22℃，自由飲水，飼固體顆粒。大鼠及飼料均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥品及試劑

阿霉素:深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司。

參力加顆粒:(人參、紅景天、葶藶子、五加皮等藥物組成)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑室提供。

蛋白芯片實(shí)驗(yàn)研究在上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿桑嚓P(guān)藥品及儀器均由該公司提供。

1.3 分組與造模

雄性Wister大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表將70只大鼠隨機(jī)編號(hào)并分為空白對(duì)照組 (20只)、模型組(25只)、中藥組 (25只)。按李玉玲等［1］的方法并加以改進(jìn)，將注射用的鹽酸阿霉素用注射用水配制成2mg/mL溶液，按4mg/kg，即2mL/kg劑量給予模型組;中藥組大鼠腹腔注射，每周1次，共4周，累積總量16mg/kg;空白對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 給藥方法

末次注射一周后給予藥物干預(yù)，空白對(duì)照組及模型組予生理鹽水2mL灌胃，中藥組給予中藥灌胃治療。給藥劑量按人與動(dòng)物體質(zhì)量 －劑量換算公式［2］:大鼠的劑量(mg/kg)=W×人的劑量 (mg/kg)，W是換算系數(shù)在這里約等于6.5，制備藥液濃度為0.185g/m1，每天2次給藥，每次2m1，共計(jì)給藥四周。

1.5 標(biāo)本采集及病理

末次灌胃禁食12小時(shí)后，每組取存活大鼠8只，用20%烏拉坦 (1g/kg)腹腔注射麻醉，將麻醉大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，沿正中線切開胸壁暴露心臟，迅速用無(wú)菌手術(shù)剪刀摘取心臟，置入裝有4℃冰鹽水的培養(yǎng)皿中沖洗，沖洗后在冰塊上剝離、剪取左室心肌，取心尖部組織置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切成10μm厚的切片，脫蠟，HE染色，鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)。部分置于液氮中保存送上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿傻鞍仔酒瑢?shí)驗(yàn)。

1.6 樣品蛋白質(zhì)抽提、定量和芯片分析

在干冰冰面上，分別切取各組大鼠適量 (250～500mg)心肌組織，加1m1含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑，勻漿后 (按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作)，測(cè)定樣品濃度。將所得符合標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)提取液吸取適量 (50～500ug)加到封閉好的蛋白芯片 (RayBioTM大鼠L系列抗體芯片 I)反應(yīng)槽中，隨后加入鏈親和素標(biāo)記抗體，室溫孵育1小時(shí)。待反應(yīng)完全后將芯片膜與化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)，通過(guò)X射線膠片曝光，使檢測(cè)結(jié)果在膠片上顯示。

1.7 圖象和數(shù)據(jù)采集與分析

X－射線膠片曝光后，將膠片上的圖象用掃描儀掃描并轉(zhuǎn)換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。運(yùn)行ScanA1yze軟件，將灰度TIFF格式圖片的點(diǎn)陣轉(zhuǎn)化為數(shù)字型數(shù)據(jù)。每張芯片的原始數(shù)據(jù)經(jīng)校正后，用來(lái)進(jìn)行樣品間細(xì)胞因子表達(dá)的相對(duì)豐度分析。其相對(duì)豐度比＞1.5或＜0.6667為臨界值，篩分出空白對(duì)照組、模型組和中藥組三者間的差異表達(dá)蛋白。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色

空白對(duì)照組心肌細(xì)胞紋理清晰，胞核位于中央，走形正常，胞漿著色均勻，間質(zhì)無(wú)擴(kuò)張充血;模型組心肌纖維明顯增粗、紊亂，細(xì)胞水腫，胞漿濃染，胞核皺縮，間質(zhì)增生，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);中藥組大鼠心肌病變范圍減少，細(xì)胞排列較整齊，心肌細(xì)胞輕度水腫，胞核形態(tài)均一，間質(zhì)無(wú)明顯增生，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 蛋白芯片

嚴(yán)格按著相對(duì)豐度比＞1.5或＜0.6667為臨界值，篩選出差異表達(dá)蛋白。經(jīng)分析，MMP－9存在差異性表達(dá)，與對(duì)照組相比，模型組表達(dá)上調(diào)，相對(duì)豐度比=0.6478;與模型組比較，治療組的表達(dá)下調(diào)，相對(duì)豐度比=0.5624;治療組與空白組相比無(wú)表達(dá)差異，相對(duì)豐度比=0.7285。

3 討論

2009 美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)ACC/美國(guó)心臟協(xié)會(huì)AHA成人心衰指南的定義是:心力衰竭是由于心臟結(jié)構(gòu)性或功能性疾病使心室充盈和射血能力受損而導(dǎo)致的一組復(fù)雜的臨床綜合征。在心力衰竭發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，由多種病因?qū)е卵簞?dòng)力學(xué)異常，神經(jīng)內(nèi)分泌和細(xì)胞因子的表達(dá)被激活，從而介導(dǎo)心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。

心室重構(gòu)是各種病因所致心力衰竭的共同病理機(jī)制，是心臟基質(zhì)成分合成或降解代謝失衡的結(jié)果。心室重構(gòu)不僅表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的凋亡、壞死、肥大和延長(zhǎng)，同時(shí)還表現(xiàn)為心肌間質(zhì)纖維膠原合成和分解代謝之間動(dòng)態(tài)平衡的破壞。而細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的平衡又取決于基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)及其組織抑制因子 (TIMPs)的平衡。文獻(xiàn)報(bào)告，心肌組織MMPs表達(dá)增加和活化與心力衰竭患者心室重構(gòu)密切相關(guān)［3］，在心室重構(gòu)和心力衰竭中起著重要作用［4］。

MMPs主要分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素及膜型MMPs(MT－MMP)。明膠酶包括明膠酶A(MMP－2)和B(MMP－9)，其中，MMP－9在心衰的發(fā)生發(fā)展中起著更為重要的作用［5］，可能成為反映心肌細(xì)胞外基質(zhì)降解的標(biāo)志物，從而反映左室重塑的過(guò)程［6］。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑。正常情況下TIMPs與MMPs呈1∶1的比例形成MMP－TIMP復(fù)合物阻斷MMPs與底物結(jié)合，調(diào)節(jié)MMPs的活性。具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的MMPs和抑制MMPs的內(nèi)源性TIMPs的良好平衡在維持正常的心臟結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用。心力衰竭發(fā)生后，降解細(xì)胞外基質(zhì)的MMPs升高，而TIMPs下降，兩者比例失調(diào)。從而降解除多糖以外的所有細(xì)胞外基質(zhì)成分，還可通過(guò)基質(zhì)降解時(shí)釋放強(qiáng)有力的基質(zhì)合成分子如基質(zhì)素及一些生物活性因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGF－β1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGF)等調(diào)節(jié)膠原的合成，最終破壞心臟纖維膠原網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致心肌纖維化－心室重構(gòu)－心臟泵功能衰竭。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:參力加顆粒能夠有效減輕心力衰竭大鼠的心肌病理變化。蛋白芯片分析結(jié)果顯示:MMP－9的表達(dá)與空白對(duì)照組相比，模型組的表達(dá)上調(diào);與模型組比較，治療組的表達(dá)下調(diào);模型組與空白組相比表達(dá)無(wú)差異。

綜上所述，參力加顆?？赡芡ㄟ^(guò)降低MMP－9的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解，還可能通過(guò)抑制基質(zhì)降解時(shí)釋放強(qiáng)有力的基質(zhì)合成分子如基質(zhì)素及一些生物活性因子，包括TGF－β1、FGF等調(diào)節(jié)膠原的合成，最終改善心臟纖維膠原網(wǎng)絡(luò)的破壞所導(dǎo)致的心肌纖維化－心室重構(gòu)－心臟泵功能衰竭的病理生理過(guò)程，從而對(duì)心力衰竭大鼠的心臟起到治療作用。

［1］李玉玲，楊建業(yè)，唐俊明等.阿霉素誘導(dǎo)大鼠心衰模型不同方案的比較［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(2):95－96.

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