配適體在食品有害物檢測(cè)中的應(yīng)用潛力

羅劍鳴，彭喜春，* ，吳希陽(yáng)，賴毅東

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632;2.東莞市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東東莞523120)

配適體在食品有害物檢測(cè)中的應(yīng)用潛力

羅劍鳴1，彭喜春1，*，吳希陽(yáng)1，賴毅東2

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632;2.東莞市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東東莞523120)

配適體是由指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出來(lái)的一段具有功能性的單鏈寡核苷酸序列，具有高效與靶目標(biāo)分子特異性結(jié)合的特性。配適體在許多領(lǐng)域研究及應(yīng)用逐漸展開(kāi)，本文對(duì)配適體在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域方面的應(yīng)用潛力進(jìn)行了分析和展望。

配適體，三甲烷類化學(xué)染料，重金屬，真菌毒素，抗生素

寡核苷酸配適體為一段具有功能性單鏈的寡核苷酸序列，包括了DNA和RNA，能與相應(yīng)的靶目標(biāo)專一性結(jié)合［1］。而這種序列是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX技術(shù))，從隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中篩選得到［2］。這種體外化學(xué)合成的隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中每條核苷酸鏈的兩端為固定堿基序列，中間是隨機(jī)堿基序列，由于這種隨機(jī)序列，決定了庫(kù)中每條鏈自然形成的空間構(gòu)象即二級(jí)結(jié)構(gòu)，具有多樣性，決定了庫(kù)中潛在地存在能與各種蛋白和低分子靶物質(zhì)有親和力的核酸配體，因而從理論上，自然界中絕大多數(shù)物質(zhì)都能分離出相應(yīng)的配適體。

1 配適體的篩選(SELEX技術(shù))

目前對(duì)配適體的應(yīng)用均利用了配適體能與多種靶分子特異性結(jié)合，并且結(jié)合緊密，效率高的優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)能在應(yīng)用中體現(xiàn)，主要是因?yàn)榕溥m體要經(jīng)歷一個(gè)篩選的過(guò)程。在體外合成的寡核苷酸庫(kù)中挑選出能與靶分子緊密結(jié)合的、理想的配適體，確保了配適體結(jié)合的特異性;而指數(shù)富集不僅能擴(kuò)增配適體的數(shù)量，并且富集后的篩選進(jìn)一步確保了配適體的特異性;之后對(duì)配適體結(jié)合位點(diǎn)的研究改良，能令配適體對(duì)靶目標(biāo)的結(jié)合更加緊密，從而確保其高效性。

1.1 配適體篩選的技術(shù)步驟

用于配適體篩選的SELEX技術(shù)普遍的可以分為5個(gè)主要的步驟的循環(huán)、結(jié)合、分離、洗脫、擴(kuò)增和調(diào)節(jié)。這種體外篩選和酶促擴(kuò)增的不斷循環(huán)模仿了一種達(dá)爾文式的選擇過(guò)程，最終能從眾多的核酸分子中篩選出具有最優(yōu)結(jié)構(gòu)并能與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的配適體［3］。

典型的SELEX過(guò)程的第一步是化學(xué)合成隨機(jī)的DNA寡核苷酸文庫(kù)，文庫(kù)是由兩端固定序列(約18～21堿基)及20～80個(gè)中間隨機(jī)堿基構(gòu)成，通常含有大約1013～1015個(gè)不同的單鏈DNA片段［4］。將目標(biāo)分子放入文庫(kù)內(nèi)的DNA中，使目標(biāo)分子和對(duì)應(yīng)的DNA片段結(jié)合，形成絡(luò)合物。分離過(guò)程中，緊密結(jié)合的絡(luò)合物會(huì)與未結(jié)合的片段，或者結(jié)合不強(qiáng)的片段分離。分離步驟在配適體篩選過(guò)程中是最重要的一環(huán)，因?yàn)檫@步能影響到后面對(duì)配適體結(jié)合特性的分析。經(jīng)過(guò)分離后，絡(luò)合物經(jīng)洗脫，使目標(biāo)分子與DNA片段分離，隨后DNA片段將用PCR技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增。擴(kuò)增后的雙鏈DNA產(chǎn)物需要經(jīng)由一定的處理，從中選出對(duì)應(yīng)的單鏈DNA寡核苷酸序列進(jìn)行純化、富集，以便下一輪的SELEX篩選。不斷地重復(fù)循環(huán)篩選/擴(kuò)增，最終便會(huì)篩選出能夠與目標(biāo)分子高結(jié)合，并能特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，即配適體。在最后一個(gè)循環(huán)，以擴(kuò)增這個(gè)步驟作為終點(diǎn)，所得到配適體就可以用于研究改良其結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合特性，以便確保其高效性和特異性［5］。

1.2 配適體的篩選及應(yīng)用發(fā)展史

1990年，Tuerk和Gold研究了T4噬菌體的DNA聚合酶以及mRNA的相互作用。RNA寡核苷酸序列是從組合核苷酸庫(kù)里篩選出的，而且實(shí)驗(yàn)證明其能與非核苷酸序列(DNA聚合酶)特異性的緊密結(jié)合，整個(gè)篩選的過(guò)程被稱作 SELEX技術(shù)［6］。同年，Ellington和Szostak運(yùn)用類似的技術(shù)從隨機(jī)的RNA庫(kù)中分離出能與特定的目標(biāo)分子特異性結(jié)合的RNA序列，這種RNA序列能折疊成穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，因此形成了能與目標(biāo)分子結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)，并將這些序列命名為配適體(aptamer)［7］。兩年后，從隨機(jī)的DNA序列庫(kù)也成功分離出了一段能與靶目標(biāo)特異性緊密結(jié)合的單鏈DNA序列［8］。隨后，SELEX逐漸建立并且不斷發(fā)展。

目前，配適體主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及電化學(xué)檢測(cè)方面。配適體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上的研究，主要為藥物開(kāi)發(fā)，例如作為某些疾病的抑制劑，此外，臨床診斷也是研究的主要內(nèi)容。作為疾病的抑制劑，其原理主要是配適體能與一些致病的受體結(jié)合，從而使疾病得到控制。如Cohen和Forzan等人分析研究了配適體與引起艾滋病的HIV病毒的相互作用，獲得了一個(gè)能夠與HIV－1 R5株病毒結(jié)合的配適體，可中和HIV病毒的感染［9］。Charlton等人在臨床診斷方面對(duì)配適體的應(yīng)用進(jìn)了研究，并提出了一種對(duì)炎癥診斷性成像的新方法［10］。在電化學(xué)檢測(cè)的研究當(dāng)中，配適體被應(yīng)用于生物傳感器的開(kāi)發(fā)研制當(dāng)中［5，11］。隨著人們對(duì)配適體巨大應(yīng)用潛力的認(rèn)識(shí)，配適體近年來(lái)被應(yīng)用到更多領(lǐng)域。

2 配適體技術(shù)在食品有害物檢測(cè)中的應(yīng)用潛力

目前，引起食品安全性的物質(zhì)的檢測(cè)大多需要昂貴的設(shè)備或者方法的假陽(yáng)性率高，因此開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法具有極大的市場(chǎng)潛力。從理論上配適體能應(yīng)用于檢測(cè)所有的靶分子，但在食品領(lǐng)域中，尤以在食品中有害物質(zhì)檢測(cè)分析中的應(yīng)用甚為少見(jiàn)，但是不可否認(rèn)該技術(shù)將在食品安全檢測(cè)中具有極大的應(yīng)用潛力。

2.1 配適體與三甲烷類化學(xué)染料

三甲烷類化學(xué)染料中，最為熟知的是孔雀石綠，它作為驅(qū)蟲(chóng)劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中?？兹甘G能夠控制真菌對(duì)水產(chǎn)品如魚(yú)類的侵害，同時(shí)也能防止原生動(dòng)物的感染，控制一些由蠕蟲(chóng)腸蟲(chóng)所引起的疾病。但是，孔雀石綠是致癌劑、致突變劑、致畸劑，能夠引起染色體斷裂以及具有呼吸毒性，毒性隨著暴露時(shí)間的增加而增大［12］。目前用于孔雀石綠檢測(cè)的方法有高效液相色譜熒光法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒法。

利用SELEX技術(shù)篩選出能夠特異性結(jié)合孔雀石綠的配適體代替抗體，可以制作成孔雀石綠檢測(cè)試劑盒。這種利用配適體的試劑盒沒(méi)有交叉反應(yīng)，能夠滿足檢測(cè)靈敏度高的要求，也無(wú)需制備抗體，將DNA或RNA作為識(shí)別分子，易合成，成本低，易于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化，因此有很大的開(kāi)發(fā)潛力。Grate等人篩選出了能夠與孔雀石綠結(jié)合的配適體的堿基序列，為試劑盒的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)［13］。對(duì)于其他有可能用于有關(guān)食品領(lǐng)域的三甲烷類化學(xué)染料，也可以用相類似的方法進(jìn)行研究。

2.2 配適體與重金屬

工業(yè)排放的汞、鎘、鉛等重金屬會(huì)對(duì)土壤，河流等造成污染，然后在農(nóng)作物、海產(chǎn)魚(yú)類等食品原材料中蓄積而進(jìn)入到人類的食物鏈中，引起人的急慢性食物中毒。食物中最為常見(jiàn)的污染包括汞、鎘、鉛還有砷等。在 GB/T 20380.1－2006及 GB/T 20380.2－2006中，用原子吸收光譜法分別對(duì)砷和汞進(jìn)行測(cè)定，在 GB/T 20380.3－2006及 GB/T 20380.4－2006中，用電熱原子光譜對(duì)鉛和鎘進(jìn)行檢測(cè)。

Ciesiolka等人對(duì)配適體和金屬離子的結(jié)合進(jìn)行了研究。他們?cè)谟?0個(gè)隨機(jī)位點(diǎn)的核糖寡核苷酸庫(kù)中挑選出了一種能與二價(jià)鋅離子結(jié)合的RNA配適體。這種配適體能與目標(biāo)分子結(jié)合的部分，是一個(gè)能隨機(jī)的結(jié)合二價(jià)離子的位點(diǎn)。將配適體進(jìn)行適度的修飾，使結(jié)合位點(diǎn)正好只能容納鋅離子的大小，這樣便能從中篩選得到目標(biāo)配適體［14］。其后，Hofmann等人則對(duì)能與二價(jià)離子結(jié)合的配適體進(jìn)行更深入的研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)合部位的不對(duì)稱嘌呤數(shù)量豐富、有G－A交互作用的RNA，就會(huì)顯示出能與二價(jià)離子結(jié)合的特異性，并挑選出了能與Ni2+結(jié)合的配適體［15］。這些研究給配適體作為重金屬檢測(cè)提供了研究思路以及基礎(chǔ)，使開(kāi)發(fā)重金屬配適體檢測(cè)試劑盒成為了可能。

2.3 配適體與真菌毒素

真菌毒素通常指的是作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，由一些真菌類微生物所產(chǎn)生的，分子量相對(duì)較少(分子量少于700)，有毒的化學(xué)物質(zhì)。農(nóng)作物被真菌毒素感染，能引起一系列的急性或慢性中毒，其中慢性中毒包括了致癌，對(duì)肝臟造成損傷，致使免疫力低下等［16］。

黃曲霉毒素屬于真菌毒素的一類，通常由黃曲霉產(chǎn)生。毒素多數(shù)出現(xiàn)在谷物、花生等農(nóng)作物以及由這些作物加工而成的產(chǎn)品當(dāng)中，有時(shí)甚至在水產(chǎn)品及畜產(chǎn)品中也有可能發(fā)生黃曲霉毒素的殘留［17］。黃曲霉毒素根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可以分成很多種，其中，以黃曲霉毒素B1的毒性最強(qiáng)。目前檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、薄層色譜法、微柱分析法以及高效液相色譜法等。

盡管目前配適體篩選及應(yīng)用技術(shù)研究得最多的是蛋白質(zhì)類靶分子［18］，對(duì)于類似黃曲霉素這種有機(jī)小分子類的靶分子，也有不少學(xué)者進(jìn)行過(guò)研究。Lauhon和Szostak利用SELEX技術(shù)，成功的在體外篩選出一種RNA配適體，這種配適體能夠與核黃素特異性結(jié)合［19］;Mannironi等人在體外篩選出能與多巴胺結(jié)合的RNA配適體，并且利用與多巴胺相類似的分子與適配體結(jié)合，從而進(jìn)一步的確定配適體與靶分子的結(jié)合部位［20］。Mann等人甚至篩選到一種分子量只有61.08的有機(jī)小分子——膽胺的配適體，而且篩選出的配適體與膽胺的結(jié)合力處在納摩爾范圍，顯示出極高的親和力［21］。

目前并未見(jiàn)有關(guān)文獻(xiàn)提及已經(jīng)篩選出可以與黃曲霉毒素特異性結(jié)合的配適體，但根據(jù)配適體篩選技術(shù)(SELEX技術(shù))的原理，從寡核苷酸庫(kù)中挑選出能與黃曲霉毒素結(jié)合的配適體是可能的。而上述研究也證明了可以在隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中篩選到與較小分子質(zhì)量的有機(jī)分子特異性結(jié)合的配適體。如核黃素的分子量376.37，多巴胺分子量為153.18，這幾種物質(zhì)都是含苯環(huán)的小分子物質(zhì)。其中核黃素與黃曲霉毒素B1的分子質(zhì)量(312.27)相近。因此，篩選出能與黃曲霉毒素B1特異性結(jié)合的配適體的可能性非常大。很多其它真菌毒素也可以類似地進(jìn)行研究。

2.4 配適體與抗生素

目前，由于抗生素的過(guò)度使用，由抗生素超標(biāo)引起的食品質(zhì)量安全問(wèn)題在國(guó)內(nèi)外引起了越來(lái)越多的重視?？股貧埩袅康臋z測(cè)是世界肉類貿(mào)易中重要的技術(shù)指標(biāo)和技術(shù)性壁壘之一，這一問(wèn)題已成為制約我國(guó)動(dòng)物產(chǎn)品出口的瓶頸。隨著儀器設(shè)備性能的提高和檢測(cè)方法的不斷改進(jìn)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)向更高的方向發(fā)展。例如歐盟規(guī)定在動(dòng)物源性食品中不得檢出氯霉素殘留，這意味著檢測(cè)儀器的檢出限就成為了標(biāo)準(zhǔn)。目前用于抗生素檢測(cè)的方法有液相色譜與質(zhì)譜連用檢測(cè)法和酶聯(lián)免疫吸附法。

近年來(lái)，國(guó)外對(duì)抗生素分子配適體的篩選做了不少研究。Berens等人篩選出了與四環(huán)素分子結(jié)合的RNA配適體，并且對(duì)配適體的結(jié)合部位作出了分析研究［22］;Wochner等人也篩選出了一種與蒽環(huán)類抗生素特異性結(jié)合的DNA配適體［23］。盡管常見(jiàn)的殘留抗生素并未篩選出對(duì)應(yīng)的配適體，但國(guó)外這些成功的篩選例子則提供了一種方法，使得篩選成為了可能。而且目前利用配適體檢測(cè)食品中的有害殘留還是空白，用配適體代替抗體用于酶聯(lián)技術(shù)中也未見(jiàn)報(bào)道，因此將抗生素分子配適體用于試劑盒制作具有非常大的開(kāi)發(fā)潛力。

2.5 配適體與食源性致病菌

Chen和Zhou等人則研究了配適體對(duì)肺結(jié)核致病菌——結(jié)核分歧桿菌的結(jié)合作用。該配適體(NK2)與結(jié)核分歧桿菌有高度的結(jié)合力以及特異性［24］。

這一研究同樣給食源性致病菌的檢測(cè)提供了一個(gè)思路，如果在篩選出來(lái)的配適體上連接一個(gè)可識(shí)別的標(biāo)記分子(如生物素標(biāo)記物)，則可開(kāi)發(fā)出一類新的食源性致病菌的檢測(cè)方法。

3 結(jié)語(yǔ)

理論上，利用SELEX技術(shù)能篩選出與任何靶目標(biāo)分子結(jié)合的配適體。目前配適體主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)以及電化學(xué)檢測(cè)方面，在食品檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用卻未有報(bào)道。由于現(xiàn)代食品檢測(cè)技術(shù)所需要的儀器設(shè)備成本高，維護(hù)費(fèi)貴，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng);而酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)雖能減少成本和檢測(cè)時(shí)間，但由于國(guó)內(nèi)缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品，以及抗體制備困難，因而將配適體技術(shù)應(yīng)用于食品檢測(cè)中具有很大的市場(chǎng)價(jià)值和潛力，而且國(guó)外研究資料提供了很多篩選方法和研究思路，也為配適體在食品檢測(cè)中應(yīng)用提供了理論的基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)

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Potential application of aptamers in harmful substance detection in food

LUO Jian－ming1，PENG Xi－chun1，*，WU Xi－yang1，LAI Yi－dong2
(1.Department of Food Science and Engineering，College of Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China;2.Dongguan Institute of Metrology and Quality Supervision Testing，Dongguan 523120，China)

An aptamer is defined as a section of functional single－stranded oligo－nucleic sequence selected from systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)that binds to its ligands with high affinity and specificity.The research and application of aptamers in many research fields had been gradually developed.The potential application in the detection of food safety of aptamers had been analyzed and discussed.

aptamer;triarylmethane dye;heavy metal;mycotoxin;antibiotic

TS201.1

A

1002－0306(2011)06－0457－04

2010－06－04 *通訊聯(lián)系人

羅劍鳴(1986－)，男，在讀碩士研究生，研究方向:食品安全。

東莞市科技計(jì)劃項(xiàng)目(200910810176)資助。