納米銀毒理學(xué)研究進(jìn)展

鄧芙蓉，魏紅英，郭新彪

北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100191

納米材料是指在三維尺度上至少有一維尺度小于100 nm的物質(zhì)。納米級粒徑使這些物質(zhì)具有與大顆粒不同的理化特性，其具有更大的比表面積，具備更大的反應(yīng)活性。納米銀是以納米技術(shù)為基礎(chǔ)研制而成的新型納米材料，因其優(yōu)越的抗菌性能，被廣泛用于醫(yī)療、食品、紡織、水質(zhì)凈化等領(lǐng)域［1-2］。日益增加的納米銀的使用逐漸引起大家對其造成的環(huán)境危害的重視。最近一項研究揭示，銀在洗涮過程中很容易滲漏到廢水當(dāng)中，從而破壞廢水處理廠處理廢水所用的有用細(xì)菌，還可對湖泊或河流中的水生生物造成威脅［3］。納米銀抗菌洗衣機(jī)的使用，使含有納米銀顆粒的洗衣廢水排入水環(huán)境，造成對水環(huán)境的污染［4］。此外，有研究表明，納米銀的抗菌性能會影響土壤中的有益菌，從而降低土壤的使用價值［5］。相對而言，目前有關(guān)納米銀對健康的影響及其機(jī)制的研究還較為局限，納米銀的毒性及其機(jī)制的研究還處于初步探索階段，有關(guān)納米銀使用的安全性還有待進(jìn)一步探討。因此，深入探討納米銀的毒性作用及其機(jī)制，對于納米銀的安全使用和開發(fā)利用有著非常重要的理論和現(xiàn)實意義。

1 納米銀的體內(nèi)試驗研究

動物試驗中納米銀的暴露方式有吸入、灌胃、氣管滴注、皮下注射或靜脈注射等，以上途徑的納米銀暴露可對動物的呼吸、皮膚、消化、免疫以及生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生影響。

1.1 呼吸系統(tǒng)毒性

Sung等給大鼠連續(xù)吸入粒徑為18～19 nm的銀顆粒90 d后，大鼠出現(xiàn)肺功能下降，肺組織有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁增厚以及小的肉芽腫樣病變［6-7］。另有研究采用同樣的納米銀顆粒和吸入染毒方式，使大鼠連續(xù)暴露納米銀28 d，未觀察到任何組織病理學(xué)改變和血清生化指標(biāo)改變［8］，該研究使用的納米銀濃度低于Sung的研究，提示納米銀的暴露時間和濃度可能是決定其毒性大小的關(guān)鍵因素。Hyun等采用納米銀(13～15 nm)對大鼠進(jìn)行重復(fù)鼻黏膜染毒，28 d后發(fā)現(xiàn)中高劑量組大鼠含有黏液素的杯氏細(xì)胞體積和數(shù)目顯著增加，黏液素中硫黏蛋白有輕微的升高，而唾液黏蛋白沒有變化。該研究盡管觀察到了納米銀對黏膜黏液素的影響，但這并不足以說明其具有毒性效應(yīng)。鑒于黏液素在人體呼吸系統(tǒng)健康及宿主抵抗力中的重要作用，因此有待更多的研究進(jìn)一步證實［9］。還有研究表明靜脈注射膠體銀顆粒，引起大鼠發(fā)生肺水腫而死亡［10］。

1.2 對皮膚的影響

納米銀顆粒在紡織品和傷口敷料中的廣泛應(yīng)用使納米銀可直接與皮膚相接觸。有研究表明，皮膚涂抹1%納米銀膏體制劑可有效抑制BALB/c小鼠皮炎的發(fā)生，具體表現(xiàn)為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-12(IL-12)分泌被抑制，同時觀察到了炎性細(xì)胞的凋亡［11］。Bhol等在豚鼠試驗中也觀察到同樣的抗炎效應(yīng)［12］。這些數(shù)據(jù)提示，納米銀在抑制炎癥方面有積極作用，可用于治療免疫性疾病或炎性疾?。?3］。但也有研究發(fā)現(xiàn)，納米銀可引起大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-α，IL-1β和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白的升高，納米銀經(jīng)呼吸攝入或消化道攝入可分別導(dǎo)致大鼠肺臟和小鼠肝臟炎癥的發(fā)生［6-7］。因此，納米銀對不同組織中炎性因子的調(diào)節(jié)作用可能有所不同，有關(guān)納米銀對細(xì)胞炎性因子分泌的調(diào)節(jié)作用還有待進(jìn)一步的研究。此外，在以豬為動物模型的一項研究顯示，納米銀可明顯促進(jìn)皮膚傷口的愈合［14］。但Supp等將含有納米銀的皮膚替代品嫁接于裸鼠，沒有觀察到任何促進(jìn)或抑制傷口愈合的作用［15］。這些結(jié)果提示納米銀對皮膚可能具有雙重作用，因此，有關(guān)納米銀對皮膚的影響及其機(jī)制還需要深入研究。

1.3 生殖毒性

有關(guān)納米銀顆粒的生殖毒性，目前僅局限于少數(shù)對魚類的體內(nèi)試驗和一些體外試驗研究。Bar-Ilan等將透明斑馬魚胚胎暴露于不同粒徑(3，10，50和100 nm)的膠體銀，銀顆粒(100和250μmol/L)暴露120 h可導(dǎo)致斑馬魚胚胎100%死亡，相同時間的金顆粒暴露只引起不到3%的死亡率;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)銀顆?？蓪?dǎo)致多種胚胎形態(tài)異常，該研究表明，納米銀可被胚胎攝入，銀的毒性可能是由其自身產(chǎn)生的，也可能是由其進(jìn)入胚胎體內(nèi)后產(chǎn)生的銀離子而導(dǎo)致的［16］。上述研究發(fā)現(xiàn)，在所有粒徑的納米銀和納米金中，銀的毒性較大;當(dāng)作用時間和濃度一定時，銀顆粒的毒性與其粒徑有關(guān)，說明納米材料的毒性與其化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。體外試驗也表明納米銀可能具有生殖毒性，Bradyich-Stolle等發(fā)現(xiàn)同劑量同時間下納米銀(15 nm)對小鼠精子干細(xì)胞株的生殖毒性大于納米鋁(30 nm)和納米三氧化二鉬(30 nm)［17］。

1.4 肝臟毒性

納米銀或銀離子經(jīng)口服或呼吸暴露后可能進(jìn)入到血液循環(huán)系統(tǒng)，到達(dá)體內(nèi)多個臟器，導(dǎo)致相應(yīng)器官的損害，其中有關(guān)肝臟損害的報道較多。Takenaka等給大鼠吸入納米銀(4～10 nm)后發(fā)現(xiàn)，雌雄大鼠的肝細(xì)胞中均出現(xiàn)空泡變性，高劑量組出現(xiàn)散在肝壞死灶，雌性大鼠還表現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系［18］。Kim等對大鼠連續(xù)灌胃納米銀顆粒(60 nm)28 d，發(fā)現(xiàn)腦、肝、腎、肺及睪丸中有明顯的納米銀蓄積，其中肝毒性表現(xiàn)最為明顯。但需要指出的是，該研究中所使用的染毒劑量特別是高劑量組的濃度太高〔低、中和高劑量組分別為 30，300，1000 mg/(kg·d)〕，使其科學(xué)價值有所降低［19］。因此，在進(jìn)行試驗設(shè)計時，一定要考慮人體暴露的實際濃度，使試驗結(jié)果更接近于真實。Cha等采用灌胃的方式分別給予小鼠2.5 mg的納米銀(15 nm)和微米銀(2～3.5μm)，3 d后納米銀暴露組肝組織出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)4種與炎癥有關(guān)的基因表達(dá)量發(fā)生改變，從而證實了納米銀經(jīng)消化道攝入對肝臟的炎癥損害［20］。

1.5 其他毒性

除以上所討論的納米銀的毒性效應(yīng)之外，有文獻(xiàn)報道納米銀還可對動物的腎臟和腦組織產(chǎn)生影響。Kim等用納米銀顆粒(60 nm)對大鼠連續(xù)灌胃28 d后，腎組織中可出現(xiàn)納米銀劑量依賴性的蓄積［19］。Rahman等對成年雄性小鼠腹腔注射25 nm的納米銀顆粒(100，500和1000 mg/kg)，24 h后發(fā)現(xiàn)小鼠腦部尾狀核、前皮質(zhì)層和海馬組織都發(fā)生了基因表達(dá)的改變。認(rèn)為納米銀可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，引起基因表達(dá)改變，導(dǎo)致凋亡發(fā)生，從而引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷［21］。該研究采用靜脈注射的染毒方式評價納米銀的神經(jīng)毒性，較為罕見，同時其采用的劑量也較高。

有關(guān)納米銀吸入后在免疫細(xì)胞中的分布情況至今鮮見報道。但Takenaka等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠吸入納米銀后在脾臟中觀察到納米銀的存在［18］，靜脈注射(LD50，67 mg/kg)或經(jīng)口給予高濃度的膠體銀可引起大鼠死亡，病理解剖發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟、脾臟和腎臟均出現(xiàn)褐色斑點，提示靜脈注射或經(jīng)消化道的納米銀暴露可對脾臟產(chǎn)生損害［10］。

2 納米銀的細(xì)胞毒性及其機(jī)制研究

多數(shù)動物試驗研究揭示了納米銀在體內(nèi)的分布、蓄積，也有研究探討了納米銀的毒性，但大部分體內(nèi)試驗對于毒性終點的觀察是以一般病理學(xué)檢查和生化指標(biāo)測定為主，對于納米銀的毒作用機(jī)制未能給出更多的解釋。近年來，一些研究者對不同表征的納米銀進(jìn)行了體外毒性及其機(jī)制的研究。多數(shù)研究認(rèn)為，與其他表征(主要是粒徑)相似的納米材料相比，納米銀的毒性較強(qiáng);納米銀的毒性效應(yīng)與其粒徑和表面修飾密切相關(guān)，對于不同的細(xì)胞類型其毒性效應(yīng)也有所差異［22-25］。納米銀的細(xì)胞毒性主要表現(xiàn)為降低細(xì)胞存活率、損傷細(xì)胞膜、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、影響炎性因子的分泌、影響細(xì)胞間隙連接通訊改變、引起DNA損傷以及誘發(fā)細(xì)胞凋亡等。

2.1 納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的發(fā)生

研究表明，納米銀暴露可引起細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并由此產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞毒性。10～50μg/mL的納米銀(15和100 nm)即可引起大鼠肝細(xì)胞株BRL3A細(xì)胞胞內(nèi)活性氧(ROS)顯著增加和谷胱甘肽(GSH)明顯下降，同時線粒體膜電位下降和細(xì)胞存活率降低，并存在明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系［24］。此外，納米銀還可引起正常人肺成纖維細(xì)胞和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞內(nèi)活性氧增加和線粒體內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)減少，細(xì)胞DNA損傷和細(xì)胞G2/M期阻滯，提示納米銀通過引起線粒體呼吸鏈損傷導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生和ATP合成受阻，二者繼而引起DNA損傷和細(xì)胞周期阻滯［23］。另有研究比較了納米銀(＜100 nm)和微米銀(250μm)對小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，大鼠血管平滑肌細(xì)胞A10以及HCT116人克隆癌細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)納米銀可使胞內(nèi)ROS升高，并可引起明顯的細(xì)胞凋亡，用N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理細(xì)胞可明顯減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，說明在納米銀的細(xì)胞毒性作用中有活性氧的參與［22］。一些研究報道，不同粒徑的納米銀誘發(fā)細(xì)胞凋亡可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激有關(guān)［22，24，26］。Hsina等發(fā)現(xiàn)納米銀可引起細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C向胞漿釋放，同時Bax由胞漿向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)納米銀暴露6 h即可引起細(xì)胞JNK，p53的磷酸化以及DNA修復(fù)酶PARP的裂解，采用NAC或JNK抑制劑(SP600125)可有效抑制JNK激酶和p53的活化，細(xì)胞凋亡率顯著降低，提示納米銀可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激而激活JNK通路，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡［22］。

納米銀誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用也與細(xì)胞類型和納米銀的表面修飾有關(guān)。Bhol等發(fā)現(xiàn)1%的納米銀膏體制劑(50 nm)可引起炎性細(xì)胞凋亡，但對皮膚角阮細(xì)胞無明顯效應(yīng)，提示對于不同的細(xì)胞類型納米銀的作用特征可能有所不同［11］。還有研究比較了不同表面修飾的納米銀(25 nm)的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)修飾(多聚糖包被)與未修飾的納米銀均可引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而前者還可引起明顯的細(xì)胞DNA損傷，推測經(jīng)表面修飾的納米銀可能通過DNA損傷而引發(fā)細(xì)胞凋亡，未經(jīng)表面修飾的納米銀可能通過其他途徑而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

2.2 納米銀對細(xì)胞的遺傳毒性

國內(nèi)有學(xué)者比較了納米銀和微米銀對HL-7702肝細(xì)胞DNA的損傷作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，納米銀可引起肝細(xì)胞DNA的明顯損傷，隨著納米銀濃度的升高，其對細(xì)胞DNA的損傷作用也隨之增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。但在同樣的試驗條件下，未觀察到微米銀對肝細(xì)胞DNA的損傷作用［27］。Hackenberg等研究也發(fā)現(xiàn)，0.01 μg/mL 的納米銀在作用1 h后即可引起人間質(zhì)干細(xì)胞DNA損傷，隨著染毒濃度(0.1，1和10μg/mL)的增加和染毒時間(3和24 h)的延長，納米銀對細(xì)胞DNA的損傷作用也顯著增強(qiáng)［28］。以上2項研究均提示，納米銀具有一定的遺傳毒性，其主要毒性表現(xiàn)為可造成細(xì)胞DNA損傷。然而，還有研究發(fā)現(xiàn)，納米銀單獨作用的遺傳毒性很弱，但當(dāng)納米銀與溴化十六烷基吡啶共同存在時，即可表現(xiàn)出明顯的遺傳毒性［29］。因此，有關(guān)納米銀的細(xì)胞遺傳毒性及其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.3 納米銀對細(xì)胞間隙連接通訊的影響

細(xì)胞間隙連接通訊(gap junctional intercellular communication，GJIC)是哺乳動物細(xì)胞間普遍存在的一種細(xì)胞間通訊，存在于除血液細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞以外的所有細(xì)胞和組織中。GJIC是相鄰細(xì)胞之間形成的一種能夠開放和關(guān)閉的親水性膜通道結(jié)構(gòu)，間隙連接間信息傳遞可協(xié)調(diào)不同細(xì)胞和組織的代謝或電傳導(dǎo)性，在組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞生長、增殖和分化及生長控制中起著重要的調(diào)控作用，對于維持多細(xì)胞生物的組織和器官間的平衡非常重要。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，在未引起明顯細(xì)胞毒性的濃度范圍內(nèi)，納米銀〔(69±3)nm〕可通過上調(diào)間隙連接蛋白Cx43而明顯促進(jìn)人肺上皮細(xì)胞GJIC，而銀離子卻未能觀察到此作用。為了更進(jìn)一步揭示納米銀和銀離子對細(xì)胞GJIC的影響機(jī)制，研究探討了納米銀和銀離子對細(xì)胞間隙連接蛋白Cx43 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米銀和銀離子在作用24 h后，均可引起細(xì)胞Cx43 mRNA表達(dá)的增強(qiáng)［30］。該結(jié)果提示，影響GJIC功能可能是納米銀發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的一個較早期的作用。該研究揭示了納米銀對GJIC的影響，并比較了其與銀離子的不同，研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示納米銀的生物安全性提供了新的研究方向。

3 小結(jié)與展望

納米銀對人體健康具有潛在的危害，很明顯，納米銀顆粒的毒性與其內(nèi)部特性及氧化狀態(tài)有關(guān)，最終導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞毒性以及遺傳毒性等的發(fā)生。然而，人們對生活中廣泛應(yīng)用的納米銀的粒徑、形式以及聚集方式仍不很清楚，毒理學(xué)評價證據(jù)不足，有關(guān)納米銀的毒代動力學(xué)，也只有少數(shù)動物試驗和病例報道的資料。在迄今為止的有關(guān)納米銀的毒性研究中，納米銀的組成成分差別很大，有關(guān)納米銀的描述和研究使用的納米銀的粒徑也不盡相同，暴露途徑也各有差異，因此很難在一起進(jìn)行比較并最終形成一個定論。今后對于納米銀的研究，筆者認(rèn)為以下問題值得重視:

(1)納米銀研究設(shè)計過程中的暴露和劑量的問題。有關(guān)納米銀的暴露問題，包括顆粒物的濃度、暴露持續(xù)時間以及所使用的模型，以往個別研究中的高濃度使得結(jié)果在外推時受到限制。

(2)納米銀和銀離子的作用問題。可以看出，以上所述的研究大都沒有探究組織中蓄積的銀是以顆粒狀態(tài)存在還是以離子狀態(tài)存在，有關(guān)銀離子在納米銀的生物學(xué)效應(yīng)中扮演怎樣的角色，納米銀對組織或細(xì)胞產(chǎn)生毒性的原因是由于納米銀的直接作用所致還是納米銀與細(xì)胞接觸之后釋放出銀離子，繼而由銀離子對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，還是二者兼而有之，目前尚無清晰的結(jié)論。

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