山西省沙棘品種AFLP的初步分析

史 鵬，呂小紅觹，劉英翠

(山西省林業(yè)科學(xué)研究院，山西太原 030012)

沙棘(Hippophae rhamnoides L)又名醋柳、酸刺、黑刺，為胡頹子科沙棘屬，是一種落葉性灌木，在我國主要分布于華北、西北、西南等地[1]。沙棘喜光、耐旱又耐澇、耐寒，能忍受－50℃的嚴(yán)寒和60℃的地面高溫，在年降雨量為200 mm的干旱地區(qū)也可以生長。沙棘對土壤要求不嚴(yán)，在pH值9.5的堿性土壤和含鹽量達(dá)1.1%的鹽堿地中都能較好生長[2]。沙棘為藥食同源植物，根、莖、葉、花、果，特別是沙棘果實(shí)含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)[3]，可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工等國民經(jīng)濟(jì)的許多領(lǐng)域[4]。

山西省約有沙棘林33萬公頃，其中成片林約有20萬公頃，約占全國沙棘林總面積的一半。近年來我省引進(jìn)了眾多沙棘品種，為充分發(fā)揮不同沙棘品種各自的優(yōu)勢，首先應(yīng)對各種來源的沙棘進(jìn)行遺傳背景分析，明確其分類地位。然而目前國內(nèi)外對于沙棘的分類研究，主要集中在形態(tài)分類領(lǐng)域[5];盡管已有學(xué)者利用分子標(biāo)記技術(shù)對沙棘進(jìn)行了研究[6]，但利用AFLP技術(shù)進(jìn)行研究的還是很少。

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (Amplified Fragment Length Polymorphism，簡稱 AFLP)兼有 RFLP和RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有所需DNA量少、多態(tài)性豐富、對基因組的覆蓋比較廣、不需要預(yù)先知道擴(kuò)增基因組的序列特征等特點(diǎn)，同時克服了RFLP技術(shù)操作復(fù)雜、多態(tài)性檢出率低，以及RAPD穩(wěn)定性差，對實(shí)驗(yàn)條件敏感的缺點(diǎn)[7-9]。AFLP已廣泛用于植物的遺傳育種、種質(zhì)資源鑒定等領(lǐng)域。我們利用AFLP技術(shù)對山西省部分沙棘品種的分子標(biāo)記與鑒定進(jìn)行了嘗試。

1 材料與試劑

供試品種為鵝黃、華林、棕秋等，均于201008采自內(nèi)蒙古林業(yè)局磴口林場沙棘種質(zhì)資源庫異地保存的山西沙棘種群。采集健康沙棘植株的成熟葉片，現(xiàn)場密封冰浴保存。液氮處理后，-80℃保存待用。 Mse I，EcoR I，T4DNA Ligase購自promega公司；2×Taq PCR MasterMix購自天根生物技術(shù)有限公司；接頭、引物由上海英駿公司合成。植物基因組提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；其它試劑如EDTA、氯化鈉、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺等均為國產(chǎn)優(yōu)級純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 基因組DNA提取

2×CTAB法提取沙棘基因組。用紫外分光光度計與1%瓊脂糖電泳檢測DNA的純度與濃度。

2.2 雙酶切和連接體系

按表1加入組分，37℃酶切4 h后80℃保溫20 min終止酶切反應(yīng)。酶切完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將連接反應(yīng)體系混勻后置于22℃PCR儀中過夜。連接產(chǎn)物稀釋10～15倍，作為預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

表1 DNA酶切和連接反應(yīng)體系

2.3 預(yù)擴(kuò)增與選擇性擴(kuò)增反應(yīng)

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)總體系為30 μL，其中包括:2×Taq PCR MasterMix 15 μL，EcoR I Pre-primer 1 μL，Mse IPre-primer 1 μL(表 2)，模板 DNA 3 μL。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2 min;94℃ 30 s，56℃1 min，72℃ 1 min，重復(fù)30個循環(huán)。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋15～20倍后作為選擇性擴(kuò)增的模板。

表2 預(yù)擴(kuò)增與選擇性擴(kuò)增引物序列

選擇性擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μL:2×Taq PCR MasterMix 10 μL，EcoR Iprimer 1 μL，Mse Iprimer 1 μL(表 2)，模板 DNA 2 μL，ddH2O 10.2 μL。 反應(yīng)程序:94℃ 預(yù)變性2 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s(每循環(huán)降溫0.7℃)，72℃ 1 min，重復(fù)13個循環(huán);95℃ 30 s，56℃30 s，72℃1 min，重復(fù)23個循環(huán)。

2.4 丙烯酰胺凝膠電泳

配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠，預(yù)電泳升溫至50～55℃。將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物加入等體積的甲酰胺染料，在90℃變性5 min后，立即置于冰上，70 W恒功率電泳2 h后銀染檢測。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 沙棘基因組提取

基因組DNA的提取是十分重要的一步，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成敗[10－11]。所得樣品經(jīng)紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳分析，如表3和圖1所示，OD260/OD280在1.7～1.9之間，表明所提取的DNA樣品純度較高，無蛋白質(zhì)或鹽類的污染。再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，由圖1可見，提取的DNA完整度較好，沒有降解，適宜用作AFLP分析。

表3 基因組DNA 260/280吸光度比值檢測

圖1 沙棘基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

3.2 基因組DNA雙酶切和連接

AFLP結(jié)果的準(zhǔn)確性主要取決于DNA酶切的徹底性和接頭連接的充分性，基因組DNA是否被完全酶切影響著最終結(jié)果。如果DNA酶切不完全，酶切片段覆蓋不了整個基因組，反映的不是真實(shí)的多態(tài)性，也就難以建立真實(shí)的分子指紋圖譜。本實(shí)驗(yàn)中使用37℃4 h酶切體系過量酶切，如圖2所示，該條件下酶切完全，條帶呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，條帶大小分布在250～1 000 bp之間，無DNA大片段殘留，完全滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖2 沙棘基因組DNA雙切檢測

3.3 預(yù)擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增在AFLP反應(yīng)中起承上啟下的作用，該體系預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物量大，產(chǎn)物都集中在300～600 bp(圖3)，樣品間一致性較好，是選擇性擴(kuò)增的理想模板，同時也說明前一步的接頭連接效率較高。

圖3 沙棘基因組DNA預(yù)擴(kuò)增凝膠電泳檢測

3.4 選擇性擴(kuò)增

如圖4所示選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳、銀染后，顯示條帶穩(wěn)定、清晰、分辨率高。雖然同一模板不同引物條帶間有明顯差異，但比較同一引物不同模板，條帶類似，即帶型多態(tài)性少，仍需要嘗試更多的選擇性擴(kuò)增引物對，以獲得理想的DNA指紋圖譜多態(tài)性分布。

圖4 沙棘基因組選擇性擴(kuò)增銀染結(jié)果

4 討論

在AFLP操作過程中，DNA的純度是對其影響最大的因素，只有獲得高純度的DNA才能保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。由于沙棘葉片含有多糖、葉綠素和多酚類物質(zhì)，對DNA的提取和分離純化造成一定困難，這些物質(zhì)和DNA結(jié)合會對雙酶切和后續(xù)PCR反應(yīng)造成干擾，因此要特別注意在提取時用酚氯仿多次抽提DNA。本實(shí)驗(yàn)中利用改良的2×CTAB法可獲得較高純度的DNA，完全滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。實(shí)驗(yàn)中選擇性擴(kuò)增引物組合選擴(kuò)出的條帶穩(wěn)定、清晰，背景影響低，說明銀染和擴(kuò)增條件適宜，為進(jìn)一步擴(kuò)大選擇性擴(kuò)增引物對的篩選數(shù)量奠定了基礎(chǔ)。

AFLP技術(shù)在動植物遺傳多樣性分析中已廣泛應(yīng)用，但在胡頹子科沙棘屬中的研究還較少，主要集中在中國沙棘、云南沙棘、蒙古沙棘等品種上[5－6]。沙棘是重要的經(jīng)濟(jì)作物資源，利用AFLP技術(shù)研究其種群遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性對沙棘的種質(zhì)資源保護(hù)具有重要意義。本研究建立了山西部分沙棘品種的AFLP反應(yīng)體系，可用于后續(xù)的遺傳標(biāo)記篩選和遺傳連鎖圖的構(gòu)建，這對山西沙棘種質(zhì)改良和分子標(biāo)記輔助育種以及種質(zhì)資源的利用與保護(hù)具有一定指導(dǎo)意義。

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