RhoA-ROCK介導(dǎo)的Moesin磷酸化對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能改變的調(diào)節(jié)作用

劉紅霞 馮國(guó)開 杜 靜 郭曉華 黃巧冰

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室

RhoA-ROCK介導(dǎo)的Moesin磷酸化對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能改變的調(diào)節(jié)作用

劉紅霞 馮國(guó)開 杜 靜 郭曉華 黃巧冰

南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室

目的：驗(yàn)證Rho A／ROCK信號(hào)通路參與晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）引起的膜突蛋白（Moesin）磷酸化，ROCK通過與Moesin直接作用導(dǎo)致Moesin磷酸化，探討AGE引起Moesin磷酸化的位點(diǎn)及其生物學(xué)效應(yīng)。方法：選用Rho A顯性負(fù)效突變體（Rho AN19）和組成型活性突變體（Rho AL63）的重組腺病毒感染細(xì)胞，應(yīng)用G-LISA試劑盒及免疫印跡法檢測(cè)Rho A活性及ROCK、Moesin磷酸化水平，并采用ROCK抑制劑處理細(xì)胞，明確Rho A／ROCK通路是否參與AGE介導(dǎo)的Moesin磷酸化；通過免疫共沉淀方法檢測(cè)ROCK與Moesin的相互作用，了解ROCK引起Moesin磷酸化的方式；通過分子克隆及體外定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建Moesin的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3／HA-Moesin及其突變體pcDNA3／HA-Moesin T558A 和pcDNA3／HA-Moesin T558D，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用免疫印跡、單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性測(cè)定及內(nèi)皮細(xì)胞骨架纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）形態(tài)和定位檢測(cè)，查明在AGEs誘導(dǎo)下的Moesin磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果：AGE以時(shí)間和劑量依賴方式引起內(nèi)皮細(xì)胞Rho A活性增高，改變Rho A活性，可以影響ROCK及Moesin的磷酸化水平；使用ROCK抑制劑，可減少M(fèi)oesin磷酸化。ROCK通過直接與Moesin相互作用，導(dǎo)致Moesin磷酸化。用丙氨酸替代Moesin的558位蘇氨酸抑制型突變體（pcDNA3-HA-Moesin T558A）可以降低AGEs引起的Moesin磷酸化水平、內(nèi)皮細(xì)胞通透性，并改善AGEs引起的F-actin重排。而用天冬氨酸替代558位蘇氨酸的激活型突變體（pc DNA3-HA-Moesin T558D）可以模擬AGEs引起的Moesin磷酸化水平、內(nèi)皮細(xì)胞通透性及F—actin重排。結(jié)論：AGE通過激活Rho A活性進(jìn)而導(dǎo)致其下游靶分子ROCK磷酸化，并通過直接與Moesin蛋白相互作用導(dǎo)致其磷酸化激活，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能的改變。AGE引起Moesin蛋白活化的位點(diǎn)為第558位蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（T558），抑制T558位點(diǎn)磷酸化可改善AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與功能的改變。

本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金No.30771028；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目No.IRT0730