培哚普利及高糖對RF/6A細胞SOCS3表達的影響△

李倩 鄭志 顧青 許迅

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種嚴重的致盲性眼病，是多種細胞因子參與的以視網(wǎng)膜血管滲漏和新生血管形成等為特征的最常見的一種糖尿病慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機制尚不完全明確，目前仍缺乏對其有效的干預(yù)手段。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)［1］，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)培哚普利對糖尿病視網(wǎng)膜具有明顯的保護作用，且這種作用獨立于其抗高血壓作用，但是其作用機制有待進一步揭示。

細胞因子信號抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)是Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT)通路的一種重要的負反饋性調(diào)節(jié)因子，多種細胞因子都能誘導(dǎo)其生成，通過對JAK2/STAT3通路的直接或間接阻斷作用［2］，可調(diào)節(jié)細胞因子引起的先天性和獲得性免疫、胚胎發(fā)育、細胞生長、分化、增殖、凋亡等過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜中也有 SOCS3的表達［3］。但是，目前關(guān)于SOCS3這一重要負調(diào)控因子在糖尿病視網(wǎng)膜中的作用及調(diào)控機制等研究較少。本研究采用高濃度葡萄糖刺激猴視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜內(nèi)皮細胞RF/6A，觀察對SOCS3表達的影響，并采用JAK2的抑制劑AG490及活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)高糖的這一作用，以了解高糖對SOCS3作用的機制。同時，利用培哚普利對RF/6A細胞進行干預(yù)，進一步探索培哚普利對糖尿病視網(wǎng)膜保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(RF/6A)株購自中國科學院上海生命科學研究所。低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、小牛血清購自美國Gibco公司;甘露醇、培哚普利、AG490、N-乙酰半胱氨酸(NAC)均購自美國Sigma公司;兔抗SOCS3多克隆抗體購自美國Abcam公司;β-actin小鼠單抗、HRP標記山羊抗小鼠IgG、HRP標記山羊抗兔IgG均購自北京四正柏生物公司;ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司。SYBRGreen Real-time PCR Master Mix購自日本TOYOBO公司，熒光定量PCR儀IQ5型購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 RF/6A細胞用含體積分數(shù)10%小牛血清、100×106U·L－1青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在含體積分數(shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至80%融合時，更換無血清的DMEM培養(yǎng)基使細胞同步化24 h后，各組加入干預(yù)藥物。

分組:第一組高糖干預(yù):每皿細胞加入高糖DMEM培養(yǎng)基(含葡萄糖25 mmol·L－1)后，37℃培養(yǎng)一定的時間(0 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h)，取細胞進行Western blotting檢測。

第二組藥物干預(yù):正常對照組(NG組，普通DMEM培養(yǎng)基，含5 mmol·L－1葡萄糖);甘露醇組(NG+M組，NG+20 mmol·L－1甘露醇組);高糖組(HG組，高糖DMEM培養(yǎng)基，含葡萄糖25 mmol· L－1);培哚普利對照組(NG+P組，NG+10 μmol· L－1培哚普利組);高糖+培哚普利干預(yù)組(HG+P組，HG+10 μmol·L－1培哚普利組);N-乙酰半胱氨酸(NAC)高糖干預(yù)組(HG+NAC組，HG+10 mmol· L－1NAC組);AG490高糖干預(yù)組(HG+AG490組，HG+10 μmol·L－1AG490組)。各組加入干預(yù)藥物后，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 Western blotting檢測RF/6A細胞中SOCS3蛋白的表達 各組細胞藥物干預(yù)完成后，吸除培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗2次后，加入預(yù)冷的細胞裂解液100 μL，冰浴振蕩30 min。用細胞刮刀刮下細胞并轉(zhuǎn)移到離心管中，于4℃、12 000 r·min－1離心15 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，即為提取的總蛋白。用考馬斯亮藍比色法測定蛋白質(zhì)含量。取等量蛋白質(zhì)樣本，與上樣緩沖液混合后煮沸5 min后置于冰上，進行十二烷基磺酸鈉丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，轉(zhuǎn)膜，50 g·L－1脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗為兔抗SOCS3(1∶1 000)，4℃過夜，TBST洗10 min×3次，加入 HRP標記山羊抗小鼠 IgG(1∶3 000)二抗室溫孵育2 h，TBST洗10 min×3次，暗室中ECL發(fā)光液覆蓋膜，X線膠片曝光，顯影，定影。將PVDF膜置于蛋白洗脫液中15 min后取出，一抗改為β-actin小鼠單抗(1∶2 500)，二抗為HRP標記山羊抗兔IgG(1∶5 000)，其余步驟同上。掃描儀掃描底片進行半定量分析。

1.2.3 RT-PCR檢測RF/6A細胞中SOCS3 mRNA的表達 采用Trizol一步法提取RF/6A細胞中總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行聚合酶鏈(PCR)擴增，總反應(yīng)體系為30 μL。使用軟件Primer premier 5.0設(shè)計引物，上海生工生物工程有限公司合成。SOCS3:上游引物:5’-AAGCTGGTGCACCACTACATGC-3’，下游引物:5’-CGGTCTTCCGACAGAGATGC-3’，擴增產(chǎn)物226 bp;β-actin:上游引物:5’-AGAGGCATTCTCACCCTGAAG-3’，下游引物:5’-AAGGTCTCAAACATGATCTGGGT-3’，擴增產(chǎn)物197 bp。反應(yīng)條件: 94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)PCR獲得的溶解曲線和擴增曲線分析結(jié)果的可靠性并設(shè)定閾值，輸出Ct值。采用比較2－△△Ct值的方法進行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 本研究數(shù)據(jù)處理運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。運用ANOVA進行多組間變量分析比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖孵育不同時間對SOCS3蛋白表達的影響

高糖分別孵育0 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h后RF/ 6A細胞中SOCS3表達的Western blotting的結(jié)果及各組相對含量的比較見圖1。SOCS3正常情況下在RF/6A細胞內(nèi)呈低水平表達，與2 h、4 h、8 h、24 h高糖干預(yù)后的結(jié)果比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(均為P＜0.001)，在高糖孵育2 h后即發(fā)現(xiàn)明顯上調(diào)(P＜0.001)，且上調(diào)幅度隨著孵育時間的延長而增加明顯，至高糖孵育24 h時的表達量與2 h相比，差異也有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而SOCS3蛋白的表達在高糖孵育48 h后顯著減少至接近正常水平，與0 h培養(yǎng)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 藥物干預(yù)對SOCS3蛋白表達的影響 各組干預(yù)的RF/6A細胞中SOCS3表達的Western blotting的結(jié)果及相對含量的比較見圖2。正常對照組和甘露醇組的SOCS3蛋白的表達量相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。高糖可誘導(dǎo)SOCS3蛋白表達顯著增加，與正常對照組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001);ROS抑制劑NAC作用后，可抑制高糖對SOCS3蛋白的誘導(dǎo)作用，與高糖組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。JAK2的抑制劑AG490也可使高糖作用下的SOCS3蛋白表達降低，與高糖組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

培哚普利能誘導(dǎo)SOCS3蛋白表達增加。培哚普利對照組(NG+P)、高糖+培哚普利干預(yù)組(HG+ P)分別與正常對照組比較，SOCS3蛋白的表達均顯著上調(diào)(均為P＜0.001);與高糖組比較，差異也有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。高糖聯(lián)合培哚普利干預(yù)組與培哚普利對照組相比，可顯著上調(diào)SOCS3蛋白的表達(P＜0.001)。

2.3 藥物干預(yù)對SOCS3 mRNA的影響 各個實驗組細胞的 cDNA產(chǎn)物，經(jīng) Real-Time PCR擴增后，SOCS3及β-actin反應(yīng)管均出現(xiàn)典型的擴增曲線，溶解曲線為單一峰。表明提取細胞RNA質(zhì)量及RTPCR反應(yīng)過程良好，無非特異性產(chǎn)物擴增。正常對照組、高糖組、高糖+培哚普利干預(yù)組、AG490高糖干預(yù)組的2－△△Ct值分別為1.00、2.69±0.18、7.87± 0.26、1.87±0.13。24 h高糖培養(yǎng)，可誘導(dǎo)RF/6A細胞SOCS3的mRNA水平較正常對照組增高，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。高糖聯(lián)合培哚普利的刺激后，對SOCS3 mRNA的誘導(dǎo)上調(diào)作用更加顯著，與高糖組相比，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。AG490干預(yù)后可抑制SOCS3 mRNA表達的增加，與高糖組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見圖3)。

Figure 2 Western blotting analysis of SOCS3 protein expression in RF/6A cells cultured in NG group，NG+M group，HG group，NG+P group，HG+P group，HG+AG490 group，HG+NAC group，respectively.Compared with NG group，*P＜0.001;Compared with HG group，△P＜0.05，#P＜0.001 NG組、NG+M組、HG組、HG+P組、NG+P組、HG+AG490組、HG+NAC組的RF/6A細胞中SOCS3蛋白表達的Western blotting結(jié)果及相對表達量的比較。與NG組比較，*P＜0.001;與HG組相比，△P＜0.05、#P＜0.001

Figure 3 RT-PCR analysis of SOCS3 mRNA in RF/6A cells cultured in NG group，HG group，NG+P group，HG+P group.Compared with NG group，＊＊P＜0.01;Compared with HG group，△P＜0.05，#P＜0.001 NG組、HG組、NG+P組、NG+P組的RF/6A細胞中 SOCS3 mRNA相對表達量的比較。與 NG組相比，＊＊P＜0.01;與HG組相比，△P＜0.05、#P＜0.001

3 討論

SOCS3是SOCS家族的成員之一，其結(jié)構(gòu)包含有中央SH2區(qū)，長度和序列可變的N區(qū)(氨基端)和一段約40個氨基酸大小的保守序列——SOCS盒(羧基端)［4］。SOCS3在視網(wǎng)膜的全層都有表達，但基礎(chǔ)表達水平極低［3］。先前的研究已證實糖尿病狀態(tài)可致SOCS3表達升高［5］。JAK/STAT通路是一條快速的從細胞外到細胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，高糖可誘導(dǎo)牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞ROS生成增加，JAK2/STAT3信號通路激活，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達上調(diào)，從而誘導(dǎo)細胞凋亡［6］，導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管的形成［7］。作為JAK2/STAT3信號途徑的重要負調(diào)控因子，過表達的SOCS3可明顯抑制高糖刺激的JAK/STAT通路及其下游的炎癥因子、生長因子、細胞外基質(zhì)蛋白等激活引起的組織損傷。本研究采用脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞作為研究對象，進一步探討高糖對SOCS3表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOCS3蛋白的表達在高糖孵育后2 h已增加，且隨著孵育時間的延長而上調(diào)，至孵育48h后降低至正常水平。這與Ortiz-Munoz等［8］的研究結(jié)果一致。

高糖是如何刺激SOCS3的表達增高呢?我們采用ROS的清除劑NAC對高糖作用下的細胞進行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)SOCS3的表達水平明顯降低，說明ROS可能位于SOCS3上游，高糖狀態(tài)下ROS的生成增加可刺激SOCS3表達上調(diào)。我們還發(fā)現(xiàn)，JAK2的抑制劑AG490也可以防止高糖誘導(dǎo)的SOCS3表達上調(diào)。我們以前的研究已發(fā)現(xiàn)ROS可引起高糖誘導(dǎo)的牛視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞JAK2/STAT3活化［9-10］，因此，我們推測高糖誘導(dǎo)RF/6A細胞早期SOCS3上調(diào)可能與ROS/JAK2/STAT3通路活化有關(guān)。增加的SOCS3在細胞中發(fā)揮負反饋調(diào)節(jié)作用，以抑制JAK2/STAT3通路的過度活化，防止炎癥反應(yīng)的過度激活。

ACEI作為一線的抗高血壓藥物，目前的研究證實它也是一種外源性新生血管抑制劑，對糖尿病視網(wǎng)膜組織有保護作用。如卡托普利可顯著減輕DR早期周細胞的腫脹與丟失［11］。在體內(nèi)卡托普利可顯著改善背景型DR血-視網(wǎng)膜屏障的功能，減少白蛋白的滲漏［12］。本課題組既往的研究發(fā)現(xiàn)，培哚普利通過抑制高糖誘導(dǎo)的線粒體ROS生成，既可下調(diào)VEGF，又可上調(diào)色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)，顯著降低高糖誘導(dǎo)的VEGF/PEDF的比值增加，同時可緩解糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管組織損傷，具體表現(xiàn)為周細胞凋亡、無細胞毛細血管生成的減少及視網(wǎng)膜血管基底膜增厚的減輕［1］。動物實驗已經(jīng)證實，卡托普利的干預(yù)可以顯著抑制JAK2/STAT3的激活［13］。我們應(yīng)用高糖聯(lián)合培哚普利對視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞進行干預(yù)，結(jié)果顯示培哚普利聯(lián)合或不聯(lián)合高糖均可刺激SOCS3的表達增加，說明培哚普利有直接上調(diào)RF/6A細胞SOCS3表達的作用。綜合上述的分析，培哚普利的這種作用可能是通過對ROS/JAK2/STAT3通路的抑制而獲得的。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)，高糖及ACEI類藥物培哚普利可顯著上調(diào)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細胞中SOCS3表達;培哚普利的這一作用可能與其對ROS/ JAK2/STAT3通路的抑制有關(guān)。

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